Bảng số liệu cũng cho thấy, cùng loại chất, cùng nồng độ, các dòng Keo lai khác nhau thì khả năng ra rễ cũng khác nhau, trong 3 dịng Keo lai thí nghiệm, có thể nhận xét rằng dịng BV586 vẫn là dòng cho tỷ lệ ra rễ cao hơn so với các dòng còn lại.
3.7. XÁC ĐỊNH THỜI GIAN HUẤN LUYỆN CÂY THÍCH HỢP
Cây mô sau khi ra rễ trong điều kiện nhân tạo đƣợc huấn luyện để thích nghi dần với các điều kiện tự nhiên. Thông thƣờng, sau khi ra rễ trong vịng 7 ngày, cây mơ đƣợc chuyển ra khu huấn luyện trong thời gian nhất định để thích nghi với điều kiện vật lý tự nhiên. Kết quả thí nghiệm về thời gian huấn luyện cây đƣợc trình bày trong Bảng 3.9.
Bảng 3.9. Kết quả thí nghiệm huấn luyện cây con Keo lai
Thời gian huấn
luyện (ngày) Tỷ lệ cây sống (%)
Chiều cao trung bình (cm) 0-3 46,4±8,5 5,3±2,1 4-6 63,2±12,1 5,7±2,1 7-10 73,8±11,7 6,2±1,9 11-14 78,9±8,6 6,3±2,0 15-20 69,5±9,2 6,1±1,9 Ftính = 14,1> Ftra bảng Ftính = 5,7> F tra bảng
Kết quả thí nghiệm cho thấy, đối với Keo lai ra rễ trong lọ (hay ra rễ in
vitro) thời gian huấn luyện tốt nhất là sau khi các chồi ra rễ đƣợc 11 -14 ngày
lúc này các chồi ra rễ đã đủ cứng cáp để có thể thích nghi dần với điều kiện tự nhiên. Mặt khác, quá trình hình thành và hồn thiện rễ đến thời điểm này cũng
là thích hợp nhất để chuyển cây con ra giá thể mới. Nếu thời gian huấn luyện ít hơn 10 ngày, các rễ và bản thân cây mơ cịn non nên ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng và phát triển tại vƣờn ƣơm. Trong khi, nếu thời gian huấn luyện (từ 15 ngày trở nên), các rễ quá dài khi cấy vào bầu rễ rất bị cong, thời điểm này đầu rễ bắt đầu chuyển sang màu đen sẽ kìm hãm việc sinh lơng hút và làm hạn chế quá trình phát sinh rễ mới sau khi cấy chuyển cây con vào giá thể. Kết quả thí nghiệm này cho thấy, so với các dòng Keo lai tự nhiên đã đƣợc nghiên cứu trƣớc đây, các dịng Keo lai mới có u cầu cao hơn cả về dinh dƣỡng lẫn chế độ và phƣơng pháp nuôi cấy (với các dòng Keo lai tự nhiên, thời gian huấn luyện chỉ 7-10 ngày là cho tỷ lệ sống cao nhất [9]).
Hình 3.9. Cây con Keo đã ra rễ được cấy vào bầu đất
3.8. XÁC ĐỊNH LOẠI GIÁ THỂ PHÙ HỢP CHO KEO LAI NUÔI CẤY MÔ MÔ
Để xác định loại giá thể thích hợp cho cây ni cấy mơ, khóa luận đã tiến hành thí nghiệm với 5 loại giá thể khác nhau. Các loại giá thể đƣợc thí
rộng rãi trong sản xuất. Cây mơ sau khi đƣợc huấn luyện từ 11-14 ngày, rửa sạch thạch, ngâm trong dung dịch Benlat C 0,3% trong vòng 2-3 phút rồi cấy vào các loại giá thể thí nghiệm. Cây đƣợc che nắng, tƣới phun sao cho đủ độ ẩm và tránh ánh nắng gắt trực tiếp. Sau 40-45 ngày cấy, kết quả thu đƣợc trình bày trong Bảng 3.10 sau đây.
Bảng 3.10. Kết quả thí nghiệm các loại giá thể cho cây con Keo lai
Loại giá thể Tỷ lệ cây sống (%) Chiều cao trung bình (cm) Cát sông 80,6±7,5 9,3±3,2 100% Đất mầu 73,5±8,1 10,6±4,7
50% Đất mầu + 50% than trấu 78,9±9,3 11,3±5,1
70% Đất mầu + 30% Than trấu 79,3±8,3 11,3±4,5
70% Đất mầu + 20% Than trấu +10%
xơ dừa 87,2±6,6 11,4±3,2 F tính=12,5>F tra bảng F tính=8,3>F tra bảng
Kết quả thí nghiệm cho thấy, cây mơ Keo lai đã ra rễ đƣợc cấy vào 5 loại giá thể khác nhau đều cho có tỷ lệ sống tƣơng đối cao (từ 73% trở nên) nhƣng mỗi loại giá thể đều có những ƣu, nhƣợc điểm nhất định. Trong đó, với giá thể cát sơng, do khả năng thốt nƣớc tốt, rễ có thể phát triển nhanh nên tỷ lệ cây sống đạt trên 80%, chiều cao cây trung bình cũng đạt trên 11cm, nhƣng lại nghèo về dinh dƣỡng và sau đó lại phải cấy chuyển từ giá thể cát sang bầu đất nên sẽ kéo dài thời gian chăm sóc và huấn luyện cây con.
Trong các giá thể bầu đất đƣợc sử dụng thì loại giá thể gồm hỗn hợp giữa bầu đất, than trấu và xơ dừa có tỷ lệ sống cao nhất và chiều cao cây con cũng đạt cao nhất trong các cơng thức thí nghiệm. Điều này có thể giải thích
nhƣ sau: trong thành phần ruột bầu có than trấu và xơ dừa (có 1 lƣợng phân hữu cơ nhất định) sẽ làm cho bầu tơi, xốp và dễ thốt nƣớc nhƣng lại có độ ẩm cần thiết cho quá trình sinh trƣởng của cây con nên cho tỷ lệ sống cao, cây phát triển tốt hơn so với các loại giá thể cịn lại.
Hình 3.10. Luống cây con Keo lai tại vườn ươm
3.9. XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CHO CÁC DỊNG KEO LAI NGIÊN CỨU
Qua kết quả thí nghiệm, luận văn đã bƣớc đầu xây dựng đƣợc quy trình nhân giống cho các dịng Keo lai nghiên cứu với các nội chính sau đây:
3.9.1. Mục tiêu quy trình
Quy trình kỹ thuật này giới thiệu những kỹ thuật cơ bản về nhân giống bằng nuôi cấy mô các cho giống Keo lai tự nhiên BV586, BV376, BB055 đã đƣợc công nhận là giống cây trồng mới.
3.9.2. Phạm vi áp dụng
Bản hƣớng dẫn kỹ thuật này đƣợc áp dụng trong tất cả các thành phần kinh tế, những nơi có điều kiện thích hợp cho sản xuất giống Keo lai tự nhiên BV586, BV376, BB055
3.9.3. Điều kiện cần thiết để áp dụng quy trình
3.9.3.1. Điều kiện khí hậu
Nhiệt độ khơng khí trung bình hàng năm 21 - 27oC, tối cao tuyệt đối dƣới 42oC, tối thấp tuyệt đối trên 0o
C.
3.9.3.2. Nguồn giống
Sử dụng dòng Keo lai BV586, BV376, BB055 đã đƣợc nhà nƣớc công nhận và do cơ quan chuyên môn cung cấp.
3.9.3.3. Điều kiện nhân lực
Có đủ nhân lực đƣợc tập huấn về kỹ thuật nhân giống giống Keo lai nói trên, có hiểu biết về kỹ thuật lâm sinh, kỹ thuật nhân giống và phòng chống sâu bệnh.
3.9.3.4. Cơ sở vật chất
Có đủ các thiết bị và thuốc phòng chống sâu bệnh và các biện pháp bảo đảm an toàn lao động
Nơi sản xuất hom phải có nhà giâm hom với hệ thống phun sƣơng đƣợc vận hành tốt hoặc có khu giâm hom với đủ thiết bị tƣới phun
3.9.4. Nội dung quy trình
3.9.4.1. Khử trùng mẫu
Vật liệu khử trùng là các chồi đạt chiều cao 10 - 15 cm và chƣa xuất hiện các chồi bất định bên nách là đƣợc thu từ cây giống gốc
Đoạn chồi đã cắt đƣợc rửa sạch dƣới vịi nƣớc chảy bằng tay, sau đó đƣợc rửa bằng nƣớc xà phịng và tráng sạch dƣới vịi nƣớc chảy, sau đó lau bằng bông tẩm cồn 70% rồi rửa lại thật sạch bằng nƣớc cất, cắt thành đoạn mẫu có ciều dài 3-5cm và có ít nhất một mắt chồi ngủ.
Khử trùng mẫu vật bằng Clorua thuỷ ngân (HgCl2) 0,1% trong thời gian từ 5 phút, tráng vài lần bằng nƣớc cất vô trùng cho sạch dung dịch khử trùng bám trên bề mặt mẫu, rồi cấy cào môi trƣờng tạo mẫu.
3.9.4.2. Nhân tạo mẫu
Môi trƣờng nhân chồi ban đầu là MS (Murashige và Skooge) cải tiến có bổ sung thêm Riboflavin 0,1 mg/lít, Biotin 0,1 mg/lít, đƣờng 30 g/lít, Agar-Agar 7 g/lít, và Polyvinyl pyrroline (PVP) 1 g/lít. Điều chỉnh độ pH = 5,8. Môi trƣờng đƣợc hấp vô trùng ở nhiệt độ 121oC ở áp suất 1,1 atm trong thời gian 20 phút. Mơi trƣờng đã hấp vơ trùng đƣợc cho vào bình cấy hình hộp hoặc bình tam giác miệng rộng.
Chồi đƣợc ni trong bình đặt trên giá có độ chiếu sáng 2500 - 3000 lux, nhiệt độ trong phòng 25oC 2oC, thời gian chiếu sang là 8h/ngày.
Trƣớc khi cấy chồi phải khử trùng cho panh gắp bằng cách đốt trên ngọn lửa đèn cồn. Sau khi cấy phải đậy lọ bằng nắp nhựa (bình hình hộp) hoặc nút bơng (bình tam giác miệng rộng).
Sau 30 - 35 ngày, khi chồi bất định dài 1,5 - 2,0 cm, cắt và cấy chuyển sang môi trƣờng nhân chồi MS cải tiến (MS*) đƣợc bổ sung 6g/lít thạch, 1,5 mg/lít BAP và các chất phụ gia, vitamin, điều chỉnh pH = 5,8 và đƣợc hấp vô trùng ở 1210C trong thời gian 20 phút.
3.9.4.3. Nhân nhanh
Môi trƣờng nhân nhanh chồi cho giống keo lai tự nhiên là mơi trƣờng MS* có bổ sung 6g/lít thạch, 30g/lít đƣờng, 1,5 mg/lít BAP hoặc 2,0mg/l, cùng các chất phụ gia, các vitamin khác điều chỉnh độ pH đến 5,8 và đƣợc hấp vô trùng trong điều kiện tƣơng tự nhƣ các môi trƣờng trên.
Chồi đƣợc ni trong bình đặt trên giá có độ chiếu sáng 2500 - 3000 lux, nhiệt độ trong phòng 25oC 2oC, thời gian chiếu sáng là 8h/ngày.
Sau đó cứ 22 - 27 ngày cấy chuyển một lần cho đến lúc đủ lƣợng chồi cần thiết để ra rễ.
3.9.4.4. Nâng cao chất lượng chồi
Môi trƣờng nhân nhanh chồi là MS* có bổ sung 6g/lít thạch, 30g/lít đƣờng, 1,5mg/lít BAP (hoặc 2,0 mg/l) + 0,5g/lít NAA cùng các chất phụ gia, các vitamin khác điều chỉnh độ pH đến 5,8 và đƣợc hấp vô trùng trong điều kiện tƣơng tự nhƣ các môi trƣờng trên.
Cấy từ 3 đến 5 cụm chồi/bình ni cấy 250ml (có từ 60-75ml mơi trƣờng) và mỗi cụm chồi có từ 3 đến 5 chồi/cụm. Chồi đƣợc ni trong bình đặt trên giá có độ chiếu sáng 2500 - 3000 lux, nhiệt độ trong phòng 25o
C 2oC, thời gian chiếu sáng là 8h/ngày.
Sau 25 - 30 ngày cấy chuyển có thể cho các chồi ra rễ.
3.9.4.5. Cho ra rễ
Môi trƣờng ra rễ cho Keo lai là 1/2 thành phần môi trƣờng MS cải tiến, bổ sung 7g/lít thạch có bổ sung IBA nồng độ 2 mg/lít, đƣờng 15g/lít và PVP 1 g/lít.
3.9.4.6. Huấn luyện cây
Các chồi keo lai sau khi đã ra rễ trong lọ (khoảng 7-10 ngày) đƣợc chuyển ra khhu huấn luyện nhằm cho cây thích nghi dần với điều kiện tự nhiên. Thời gian huấn luyện từ 11-14 ngày.
3.9.4.7. Ra ngôi và cấy cây vào bầu đất:
Sau thời gian huấn luyện, cây mô đã ra rễ đƣợc cấy vào bầu đất với thành phần nhƣ sau: 70% đất mầu, 10% phân campot và 20% hỗn hợp ruột bầu, có thể thay hỗn hợp ruột bầu bằng than trấu và xơ dừa.
Lấy cây mầm từ trong lọ, rửa hết thạch bằng nƣớc sạch rồi xử lý bằng benlat C nồng độ 3% trong 3-5 phút.
Dùng que cấy cắm vào giữa bầu một lỗ có độ sâu 2-3cm, dùng ngón tay cái và ngón trỏ giữ cho cây thẳng đứng, đƣa nhẹ cây vào lỗ có trên bầu, khơng đƣợc làm cong rễ, lấy que cấy ấn nhẹ xung quanh gốc để rễ cây tiếp xúc với đất, cấy đến đâu dùng ơ doa tƣới nhẹ đến đó.
Sau khi cấy cây mô vào bầu cần chú ý che nắng và bảo đảm ẩm cho cây trong một tuần đầu, sau đó theo chế độ chăm sóc thơng thƣờng cho đến khi cây đủ tiêu chuẩn xuất vƣờn.
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN
1- Phƣơng pháp khử trùng thích hợp cho các dịng keo lai nghiên cứu là sử dụng dung dịch HgCl2 nồng độ 0,1% trong vòng 5 phút cho tỷ lệ bật chồi hữu hiệu đạt 37,5%.
2- Môi trƣờng nuôi cấy cơ bản cho các dịng Keo lai nghiên cứu là mơi trƣờng MS cải tiến về thành phần và nồng độ các chất đa lƣợng, vi lƣợng (kí hiệu MS2).
3- Môi trƣờng nhân chồi thích hợp cho các dịng keo lai BV376, BV586 và BB055 là mơi trƣờng MS2 có bổ sung BAP nồng độ 1,5mg/l và NAA 0,5mg/l.
4- Chế độ chiếu sáng thích hợp để ni cấy các dịng Keo lai nghiên cứu là chiếu sáng 7-9h/ngày với cƣờng độ ánh sáng 2.000-2.500 lux trong cả chu kỳ nuôi cấy (25 ngày/chu kỳ).
5- Phƣơng thức cấy có hiệu quả nhất trong việc kích thích tạo chồi cũng nhƣ tiết kiệm đƣợc không gian dinh dƣỡng cho các dòng Keo lai nghiên cứu là cấy từ 3 đến 5 cụm chồi/bình ni cấy 250ml (có từ 60-75ml mơi trƣờng) và mỗi cụm chồi có từ 3 đến 5 chồi/cụm.
6- Môi trƣờng ra rễ thích hợp cho các dịng Keo lai nghiên cứu là 1/2MS2 + IBA nồng độ 1,5-2,0mg/l cho tỷ lệ ra rễ trên 80%.
7- Thời gian huấn luyện cây con ra rễ trƣớc khi đƣa ra vƣờm ƣơm là từ 11-14 ngày.
8- Giá thể thích hợp nhất để cấy cây mô đã ra rễ là 70% Đất mầu + 20% Than trấu +10% xơ dừa cho tỷ lệ sống trên 80% cây sinh trƣởng tốt.
9- Từ các kết quả trên, đã đề xuất đƣợc quy trình nhân giống bằng ni cấy mô cho các dịng Keo lai nghiên cứu nhằm từ đó chuyển giao giống và quy trình nhân giống cho các đơn vị nghiên cứu và sản xuất giống cây lâm nghiệp để phát triển các giống mới này vào trồng rừng sản xuất.
4.2. KIẾN NGHỊ
Do hạn chế về thời gian tiến hành các thí nghiệm, các nghiên cứu trong khuôn khổ luận án này mới chỉ là những kết quả bƣớc đầu. Vì thế, để xác định phƣơng pháp nhân nhanh tối ƣu cũng nhƣ xây dựng quy trình nhân giống cho các dịng Keo lai này với mục tiêu chuyển giao công nghệ nhân giống vào thực tiễn sản xuất, thời gian tới cần có thêm các nghiên cứu bổ sung với quy mô rộng hơn nhƣ:
+ Đánh giá sinh trƣởng bƣớc đầu của cây con trong giai đoạn vƣờn ƣơm cũng nhƣ ảnh hƣởng cuả thời vụ tới kết quả huấn luyện cây con tại vƣờn ƣơm.
+ Cải tiến, tối ƣu hóa mơi trƣờng và Phƣơng pháp nuôi cấy cho phù hợp với điều kiện sản xuất ở quy mơ phịng thí nghiệm từ đó xây dựng và hàn thiện quy trình nhân giống để áp dụng vào sản xuất thực tiễn.
+ Đánh giá khả năng nhân giống cho từng đối tƣợng riêng rẽ cũng nhƣ nghiên cứu mở rộng về phƣơng pháp ra rễ chồi non bằng chấm thuốc bột kích thích tạo rễ trong điều kiện vƣờn ƣơm.
4. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Đức Thành, 2000, Nuôi cấy mô tế bào thực vật - Nghiên cứu và
ứng dụng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
2. Lê Đình Khả, Đồn Thị Mai 2002, Một số phƣơng thức nhân giống sinh dƣỡng trong sản xuất lâm nghiệp‖, Công nghệ nhân và sản xuất giống cây trồng, giống cây lâm nghiệp và giống vật nuôi, Nhà xuất bản Lao động xã hội
(Chủ biên: Ngô Thế Dân, Lê Hƣng Quốc). Hà Nội, tr. 166-182.
3. Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2001, Nhân giống vơ tính và trồng rừng dịng vơ
tính, Nhà xuất bản Nơng nghiệp, Hà Nội, 120 trang.
4. Đồn Thị Mai, Lê Sơn, 2011, Báo cáo tổng kết đề tài KHCN cấp Nhà nước
―Nghiên cứu nhân nhanh giống Keo lai tự nhiên, Keo lai nhân tạo, Bạch đàn uro, Bạch đàn lai nhân tạo (mới chọn tạo) và Lát hoa bằng công nghệ tế bào‖.
Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam
5. Gupta P.K., Nadgir A.L., Mascarenhas A.F., Jagannathan V, 1980, Tissue culture of forest trees: Clonal multiplication of Tectona grandis L.
(teak) by tissue culture. Plant Science Letters, 7 (3): 259-268
6. Girijashankar, 2012, In vitro regeneration of Eucalyptus camaldulensis.
Physiol Mol Biol Plants, 18 (1): 79–87.
7. Das T, Mitra GC, 1990, Micropropagation of Eucalyptus tereticornis
Smith. Plant cell Tissue Organ Cult, 22: 95 - 103.
8. Warrag E.I., Lesney M. S. and Rockwood D. L., 1990. Micropropagation of field tested superior Eucalyptus grandis hybrids. Kluwer
Academic Publishers. New Forests, 4: 67 – 79.
9. Roberson Dibax, Cristiane de Loyola Eisfeld, Francine Lorena Cuquel, Henrique Koehler, Marguerite Quoirin, 2005, Plant regeneration from cotyledonary explants of Eucalyptus camaldulensis. Sci. Agric., 62 (4): 406 -
10. Ho C. K., Chang S. H., Tsay J. Y., Tsay C. J., Chiang V. L., Chen Z. Z., 1998, Agrobacterium tumefaciens - mediated transformation of Eucalyptus
camaldulensis and production of transgenic plants, Plant Cell Rep., 17: 675-680.
11. Sharma S.K., Ramamurthy V., 2000, Micropropagation of 4-year-old elite Eucalyptus tereticornis trees, Plant Cell Report, 19: 511 – 518.
12. González E.R., Andrade A., Bertolo A.L., Lacerda G.C., Carneiro R.T., Defávari V.A.P., Labate M.T.V., Labate C.A., 2002, Production of transgenic Eucalyptus grandis × E. urophylla using the sonication-assisted
Agrobacterium transformation (SAAT) system, Functional Plant Biology, 29:
97-102.
13. Joshi I., Bisht P., Sharma V. K, Uniyal D. P., 2003, In vitro clonal