Đây là điều kiện cơ bản đầu tiên của quá trình nuôi cấy in vitro. Nếu
điều kiện này không đƣợc đảm bảo thì mẫu nuôi cấy hoặc môi trƣờng sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết, các thí nghiệm ở giai đoạn sau sẽ bị ngừng lại. Do đó, trong toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro cần đảm bảo điều kiện vô
trùng tuyệt đối. Muốn đảm bảo điều kiện vô trùng cần có phƣơng pháp khử trùng mẫu thích hợp, phƣơng tiện khử trùng hiện đại, buồng và bàn nuôi cấy vô trùng. Chọn đƣợc đúng phƣơng pháp khử trùng sẽ cho tỷ lệ sống cao, môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp sẽ đạt tốc độ sinh trƣởng nhanh [29].
Nồi hấp tiệt trùng: sử dụng cho việc khử trùng môi trƣờng nuôi cấy, dụng cụ nuôi cấy bằng hơi nƣớc có áp suất và nhiệt độ cao (1,1 - 1,2 atm, 120 -1300C).
Tủ sấy: để sấy khô các dụng cụ thuỷ tinh và dụng cụ cấy
Dung dịch khử trùng: để khử trùng vật liệu đƣa vào nuôi cấy ngƣời ta thƣờng sử dụng các dung dịch nhƣ HgCl2 (Clorua thuỷ ngân), NaOCl (Hypoclorit Natri), Ca(OCl)2 (Hypoclorit Canxi), H2O2 (ôxi già)…cồn dùng để khử trùng mẫu sơ bộ và đốt các dụng cụ khi nuôi cấy.
Phễu lọc vô trùng: dùng để khử trùng các dung dịch, không khử trùng đƣợc ở nhiệt độ cao nhƣ dung dịch Enzym hoặc một số chất điều hoà sinh trƣởng. Hiện nay, ngƣời ta thƣờng sử dụng một hệ thống bơm khử trùng dung tích lớn để thanh trùng các dung dịch nuôi cấy khi nuôi cấy tế bào trần hay huyền phù tế bào.
Buồng vô trùng: nơi đặt bàn cấy cần kín gió, cao ráo, sạch sẽ. Buồng phải đƣợc tiệt trùng liên tục trƣớc và sau khi làm việc bằng Foocmon kết hợp chiếu đèn tử ngoại.
Bàn cấy vô trùng: Tốt nhất là sử dụng bàn cấy Laminair flow box. Thiết bị này làm việc theo nguyên tắc lọc không khí vô trùng qua màng và thổi không khí vô trùng về phía ngƣời ngồi thao tác.