Sau khi khảo sát hai phương pháp kháng khuẩn ở trên, đề tài sử dụng phương pháp đối kháng trực tiếp để xét khả năng kháng khuẩn với E. coli. Khuẩn E. coli ATCC25922 được xin giống ở bộ mơn Cơng nghệ sinh học, Khoa cơng nghệ hố học, trường Đại học Bách khoa Đà Nẵng.
c, Xây dựng phương trình tương quan của sự tăng trưởng B. subtilis và mật độ quang
Để tiến hành các thí nghiệm về tính đối kháng và xác định khả năng hình thành biofilm sau này, đường chuẩn của sự tăng trưởng B. subtilis được tiến hành khảo sát. Mặt khác, việc xây dựng đường chuẩn sự tăng trưởng của vi khuẩn giúp cho quá trình thí nghiệm đơn giản hơn khi quy đổi tương đương độ hấp thụ ở bước sĩng 600nm hay cịn gọi là mật độ quang ở bước sĩng
Đĩa thạch chứa mơi
trường đặc hiệu Lổ giếng chứa mẫu
600nm (OD600) với mật độ tế bào CFU/ml. Như đã được biết, các nghiên cứu về sự tăng trưởng vi khuẩn yêu cầu cấy các tế bào sống sĩt vào mơi trường nuơi cấy vơ trùng và ủ nuơi cấy trong điều kiện nhiệt độ, pH và khí tối ưu. Trong điều kiện này, các tế bào sẽ sinh sản nhanh chĩng và động lực của sự phát triển của vi sinh vật cĩ thể được lập biểu đồ bằng đường cong tăng trưởng quần thể, được xây dựng bằng cách vẽ biểu đồ sự gia tăng số lượng tế bào so với thời gian ủ và cĩ thể được sử dụng để xác định các giai đoạn chu kỳ sinh trưởng. Nĩ cũng tạo điều kiện thuận lợi cho việc đo đếm số lượng tế bào và tốc độ phát triển của vi sinh vật trong các điều kiện tiêu chuẩn được biểu thị bằng thời gian pha của nĩ, thời gian cần thiết để một quần thể vi sinh vật tăng gấp đơi. Các giai đoạn phát triển của vi sinh vật được phân thành 4 giai đoạn (Hình 2.3): pha lag, pha log (pha lũy thừa, pha tĩnh, pha chết (pha suy vong).
Hình 2.3 Đường cong sinh trưởng của vi sinh vật
Dựa vào nguyên lý tăng trưởng của vi sinh vật, mối quan hệ tăng trưởng của vi sinh vật và mật độ quang cĩ thể biểu hiện ở pha log. Vì thế, đường chuẩn thể hiện quan hệ này được thiệt lập để cĩ thể đo nhanh số lượng
Time M ật đ ộ tế b ào , C FU /m l Pha tĩnh Pha chết Pha Lag Y Pha Log
tế bào vi sinh vật cịn sống qua mật độ quang ở bước sĩng 600nm mà khơng cần trãi qua 24 giờ ủ và đếm khuẩn lạc. Quá trình thiết lập đường chuẩn này là rất cần thiết cho các phân tích và xử lý số liệu sau này. Các bước tiến hành được thiết lập như sau:
- Cấy phần nuơi cấy thuần khiết của một lồi vi khuẩn trên đĩa thạch và ủ trong 24 giờ.
- Lấy khuẩn lạc ra khỏi đĩa và tăng sinh cho đến khi đạt được mật độ quang (OD) ở bước sĩng 600nm bằng máy quang phổ trong khoảng từ 1-1,5
- Pha lỗng huyền phù bằng nước cất và ghi lại các giá trị OD khác nhau như 0,2, 0,4. 0,56, 0,72, 0,9, vv sử dụng máy quang phổ. Đo các giá trị này trong thời gian rất ngắn. Vì thời gian hình thành vi khuẩn rất ngắn, vì vậy cĩ thể đậy ống nghiệm/ống vi sinh trên nước đá để giảm nhiệt độ nhằm ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn.
- Lại pha lỗng nối tiếp từng huyền phù đã pha lỗng từ 10-3-10-7 để tiến hành trãi khuẩn lên đĩa petria chứa mơi trường (Hình 2.4).
Hình 2.4 Sơ đồ pha lỗng mẫu
- Lấy 100µl huyền phù đã pha lỗng và trải lên đĩa thạch rồi ủ 24 giờ ở nhiệt độ mơi trường cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn cụ thể. Nếu số khuẩn lạc nhiều hơn 300, cần tiến hành pha lỗng tiếp tục. Đếm số khuẩn lạc và tạo đường chuẩn so với các giá trị OD đo được ở trên. Một đường thẳng
tuyến tính và phương trình là y = ax + b (với y, x là OD600 hoặc CFU/ml) được vạch theo số liệu thu được. Bằng cách thiết lập đường chuẩn này, và cĩ thể giả định mật độ/số lượng vi khuẩn bằng cách chỉ đo giá trị OD.
2.4.5 Xác định khả năng hình thành biofilm
Khả năng sản sinh màng sinh học của B. subtilis phân lập được thực hiện trong các ống nghiệm.
Nuơi cấy mẻ gốc (stater culture): B. subtilis (đã được phân lập và đánh số bởi ngân hàng Genome NCBI) được nuơi cấy trong mơi trường LB ủ ở 37oC ở 150 vịng/phút trong 5 giờ cho tới khi kiểm sốt được mật độ quang OD600 đạt gía trị 1,0[16]. Mơi trường LB được củng cố bằng cách thêm 1,5% (w/v) agar để thu được LBA.
- Thí nghiệm tạo màng sinh học: đối với màng sinh học trên mơi trường rắn, tiến hành hút 5µl dịch từ mẻ gốc được đặt trên các đĩa thạch đã chứa mơi trường LBA. Các đĩa được ủ ở 30o
C trong khoảng thời gian từ 5 – 7 ngày. Hình ảnh của màng sinh học cĩ kích thước khác nhau được chụp cứ sau 24 giờ sử dụng máy ảnh kĩ thuật số Sony A6300[37]. Kích thước màng được đo hằng ngày cho tới khi khơng đổi. Đối với màng sinh học hình thành trong mơi trường lỏng, hút 1ml dịch từ mẻ gốc cho vào ống nghiệm thuỷ tinh đã chứa 9ml LB đã được tiệt trùng. Sau đĩ, các ống nghiệm được nuơi qua đêm trên máy lắc 130 rpm nhằm tăng sinh tạo dịch huyền phù. Sau một đêm cấy, các ống nghiệm được đem đi ủ ở cùng điều kiện với màng sinh học trên mơi trường rắn (Hình 2.5).
Hình 2.5 Ống nghiệm nuơi cấy qua đêm trên máy lắc
2.4.6 Xác định sự ảnh hưởng của nồng độ muối và pH đến sự phát triển và hình thành biofilm của B. subtilis được phân lập. triển và hình thành biofilm của B. subtilis được phân lập.
a, Ảnh hưởng của pH tới tăng trưởng và hình thành biofilm của B. subtilis
Mơi trường tăng sinh B. subtilis được chọn là LB với các nồng độ pH được chuẩn bị từ 2 – 10. Các ống nghiệm cĩ chứa mơi trường LB cĩ thể tích xác định được điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1M và HCl 1M với bước nhảy là 0.5. Sau khi các ống nghiệm chứa mơi trường LB đã được điều chỉnh pH đem đi tiệt trùng và tiến hành cho thêm vào thể tích xác định dịch B. subtilis. Các ống nghiệm được tăng sinh trong vịng 24 giờ ở nhiệt độ 37 oC và lắc ở 130 rpm. Sau 24 giờ, hỗn hợp trong ống nghiệm được đo OD600 để xây dựng đồ thị tăng trưởng của B. subtilis theo độ pH. Dung dịch cịn lại trong các ống nghiệm được cất vào tủ ủ ở nhiệt độ 37oC trong vịng 5 ngày để đánh giá khả năng tạo biofilm của B. subtilis. Sau 5 ngày, màng sinh học được thu nhận, làm khơ và ghi lại khối lượng của từng màng. Cũng 1 dãy thí nghiệm như vậy, màng biofilm lại được thu hoạch, hồ tan lại trong nước pepton và được xác định số vi khuẩn bằng phương pháp trãi đĩa thạch petri trên mơi trường LB (Hình 2.6). Trong quá trình làm thí nghiệm này, các ống
nghiệm chứa mơi trường LB khơng cho khuẩn được sử dụng làm mẫu đối chứng.
Hình 2.6 Phương pháp xác định vi khuẩn trong biofilm bằng cách pha lỗng trãi lên mơi trường LBA, xác định mật độ vi khuẩn CFU/ml
b, Ảnh hưởng của nồng độ muối tới tăng trưởng và hình thành biofilm của B. subtilis
Để đánh giá khả năng sống sĩt trong mơi trường mặn, chuỗi thí nghiệm tăng sinh B. subtilis trong các mơi trường LB với các nồng độ muối NaCl được cho thêm vào từ 1g L-1 đến 40g L-1
. Cách tiến hành tăng sinh và khả năng tạo thành biofilm của B. subtilis cũng được tiến hành như trên mục 2.4.6 a. Trong quá trình làm thí nghiệm này, các ống nghiệm chứa mơi trường LB khơng cho khuẩn được sử dụng làm mẫu đối chứng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.5 Phân tích hình ảnh cộng đồng vi khuẩn trong biofilm bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) hiển vi điện tử quét (SEM)
Nhằm tìm hiểu sự gắn kết các vi khuẩn trong màng sinh học, các màng sinh học hình thành trong ống nghiệm sau 5 – 7 này ủ trong điều kiện ở trên
phần 2.3.5, được thu hoạch sang các ống ependorf, các ống này được quấn biofilm để gửi đi chụp dưới kính hiển vi điện tử quét ở Viện vệ sinh dịch tể trung ương, số 01 Yecxanh, Hà Nội. Các bước tiến hành được mơ tả trong bài báo đã được cơng bố vào năm 2020 của tác giả Nguyễn Thị Đơng Phương và các cộng sự[27].
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus từ mẫu biofloc vi tảo được nuơi trong nước thải thủy hải sản nước thải thủy hải sản
3.1.1. Phân lập vi khuẩn
Với phương pháp phân lập vi khuẩn được nêu trong phần nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Vi khuẩn được thu nhận mang đi kiểm tra hố sinh (Hình 3.1).
Hình 3.1 Các khuẩn lạc mọc lên bề mặt mơi trường LBA
Để làm giảm các bước chọn lọc khuẩn lạc làm thuần, tất cả các khuẩn lạc cĩ kích thước lớn, cĩ răng cưa, bề mặt nhăn nheo được chọn cho việc xác định Gram, những khuẩn lạc cĩ kết quả Gram (-) sẽ được loại khỏi quá trình đánh giá sinh hố tiếp tục. Các khuẩn lạc cho kết quả Gram (+) đã được kiểm tra đặc tính sinh hố đặc trưng của vi khuẩn B. subtilis thơng qua các phản
ứng sinh hố, và cho kết quả được nêu ra trong Bảng 3.1. Dựa vào kết quả Gram staining mà chọn lọc được 15 khuẩn lạc từ 30 khuẩn lạc ban đầu.
Bảng 3.1 Đặc tính sinh hố đặc trưng của vi khuẩn B. subtilis
STT Kí hiệu khuẩn lạc
Gram
staining Cat Indole
Tính di động VP Lên men với Glucose 1 KL1 + + - + + + 2 KL2 + + - + + + 3 KL3 + + - + + + 4 KL4 + + - + + + 5 KL5 + + - + - + 6 KL6 + + - + + + 7 KL7 + + - + + + 8 KL8 + + - + + + 9 KL9 + + - + + + 10 KL10 + + - + + + 11 KL11 + - - + + +
12 KL12 + + - + + +
13 KL13 + + - + + +
14 KL14 + + - + + +
15 KL15 + + - + - +
Dựa vào bảng trên cĩ thể thấy rằng, với phản ứng Catalase (-), phản ứng VP (-) thì khơng phải là đặc tính sinh hố của B. subtilis, nên cĩ thể loại bỏ KL5, KL11 và KL15 ra khỏi các mẫu đem đi thực hiện quá trình PCR và định danh. Tất cả các khuẩn lạc cịn lại được trãi qua quá trình PCR. Sản phẩm của quá trình PCR được gửi đi định danh tại cơng ty The First BASE Laboratories Sdn Bhd, Malaysia. Dữ liệu (database) của kết quả giải trình tự được phân tích thành cây Genome bằng phần mềm Mega 7. Cây Genome được biểu hiện như Hình 3.2. sau:
Với kết quả giải trình tự và phân tích cây genome, các khuẩn lạc cĩ kí hiệu KL12, KL13 và KL14 cĩ độ tương tự với B. subtilis tới 99%. Mặc khác, các khuẩn lạc được mang đi định danh được gửi ở ngân hàng Genome NCBI với số hiệu được đăng kí như Bảng 3.2.
Bảng 3.2 Kết quả giải trình tự được kí gửi dữ liệu ở ngân hàng Genome STT Mẫu Độ tương tự
% Lồi Số hiệu kí gửi
1 KL1 90% B. cereus MT300393 2 KL2 90% B. cereus MT300394 3 KL3 90% B. cereus MT300395 4 KL4 90% B. cereus MT300396 5 KL6 90% B. cereus MT300397 6 KL7 90% B. cereus MT300398 7 KL8 90% B. cereus MT300399 8 KL9 90% B. cereus MT300400 9 KL10 90% B. cereus MT300401 10 KL12 99% B. subtilis MT300402 11 KL13 99% B. subtilis MT300403 12 KL14 99% B. subtilis MT300404
Với kết quả giải trình tự như đã được trình bày ở trên, các khuẩn lạc cĩ kí hiệu KL12, KL13 và KL14 được giữ lại giống và được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2 Đánh giá khả năng đối kháng của B. subtilis với E. Coli
a, Xác định tính đối kháng của B. subtilis phân lập với E. Coli
Với phương pháp đánh giá kháng khuẩn được nêu trong phần phương pháp nghiên cứu, các khuẩn lạc KL12, KL13 và KL14 được tiến hành thử nghiệm tính đối kháng của chúng với chủng E. coli ATCC25922. Kết quả được thể hiện trên Hình 3.3 như sau:
Hình 3.3 Khả năng kháng khuẩn của B. subtilis phân lập đối kháng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
E. coli ATCC25922
LB: mơi trường; DW: nước cất; Blank: để trống.
Với kết quả thể hiện trên Hình 3.3 và đo đạt đường kính vùng ức chế vi khuẩn đối kháng, KL12, KL13 và KL14 cho khả năng kháng khuẩn với E. coli ATCC25922 với đường kính vùng ức chế 15,2 ± 0,3 mm. Kết quả này cho thấy rằng, B. subtilis được phân lập từ mơi trường khác khơng phải từ đất như các cơng trình nghiên cứu khác cũng cho khả năng kháng khuẩn tương tự.
Ví dụ, B. subtilis KKU213 được phân lập từ đất sâu khác 30cm và hoạt chất sinh học thơ trong B. subtilis KKU213 CFS thể hiện hoạt tính kháng khuẩn chống lại một số vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là các mầm bệnh truyền qua thực phẩm như B. cereus, S. aureus và L. monocytogenes. Do bản chất là sinh vật sống trong đất, B. subtilis KKU213 cĩ khả năng chịu được mơi trường khắc nghiệt và tạo ra các loại hợp chất chứa các chất kháng khuẩn
KL12 DW Blank LB KL13 Blank LB DW KL14 LB Blank DW
như vi khuẩn, lipopeptit và kháng sinh để chống lại các vi sinh vật cạnh tranh trong đất là khơng đáng ngạc nhiên[48] [49]. Hoạt động sản xuất và ức chế của vi khuẩn do Bacillus.sp sản xuất, cịn phụ thuộc vào mơi trường, nhiệt độ, thời gian ủ và kỹ thuật được sử dụng để phát hiện. Đối với KKU213, mơi trường LB phù hợp hơn mơi trường BHI để sản xuất và kích hoạt hoạt động của bacteriocin. BHI là một mơi trường tăng trưởng cĩ giá trị dinh dưỡng cao so với LB. Do đĩ, LB cĩ thể giải định các điều kiện mơi trường cơ bản và thiết yếu, chẳng hạn như khi cạnh tranh với các vi sinh vật khác trong mơi trường, và do đĩ cĩ thể khiến chủng KKU213 tạo ra nhiều chất kháng khuẩn hơn trong mơi trường nuơi cấy. Trong hầu hết các trường hợp, sản xuất bacteriocin phụ thuộc vào tốc độ tăng trưởng và thường bắt đầu trong giai đoạn giữa log và đạt đỉnh điểm ở giai đoạn chuyển tiếp giữa pha log và pha tĩnh[81].
b, So sánh tính đối kháng của B. subtilis phân lập từ lớp ngoại bào và B. subtilis phân lập từ đất
Cũng tương tự với cách thực hiện như phần 3.1.2.a, nhưng trong phần này sự so sánh tính đối kháng E. coli ATCC25922 được thực hiện trên đối tượng B. subtilis phân lập từ nghiên cứu này và B. subtilis cĩ nguồn gốc từ đất. B. subtilis BSB1 được mua giống trên Sigma Aldrich và đã được cất trữ ở -20oC, tại phịng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật. Các giống này trước khi bước qua các thử nghiệm tính kháng khuẩn, được tăng sinh trong mơi trường LB cho tới khi đạt được OD600 xung quanh giá trị 1,0. Đối với thí nghiệm về sau, KL12 được lựa chọn là B. subtilis được phân lập và sử dụng cho nghiên cứu này. Phương pháp để đánh giá tính kháng khuẩn của B. subtilis phân lập từ nghiên cứu này và B. subtilis
cĩ nguồn gốc từ đất được thực hiện như trên. Kết quả Hình 3.4 cĩ thể cho thấy sự kháng khuẩn của B. subtilis cĩ kí hiệu KL12 và B. subtilis BSB1.
Hình 3.4 So sánh tính đối kháng của vi khuẩn B. subtilis phân lập từ EPS và B. subtilis cĩ nguồn gốc phân lập từ đất
8: Vịng ức chế sinh ra bởi KL12; 8s: Vịng ức chế sinh ra bởi B. subtilis BSB1; 8: Mơi trường LB; Nc: nước cất tiệt trùng; 11 và 11’:
khơng đề cập.
Cĩ thể thấy rằng dịng phân lập KL12 cĩ khả năng kháng khuẩn được xác định dựa trên các đặc điểm kiểu hình, sinh hĩa và kiểu gen (chuỗi gen 16S rRNA) tương tự với dịng vi khuẩn từ đất. Kết quả của nghiên cứu này phù hợp với các nghiên cứu được thực hiện bởi Al-Ajlani và Hasnain, trong đĩ các phân lập vi khuẩn đất từ đất Punjab (Pakistan) được xác định là B. subtilis trên cơ sở phân tích trình tự gen 16S rRNA hình thái, sinh hĩa và kiểu gen (chuỗi gen 16S rRNA) tương [63]. Ảnh hưởng của các thơng số khác