2.4.6 Xác định sự ảnh hưởng của nồng độ muối và pH đến sự phát triển và hình thành biofilm của B. subtilis được phân lập. triển và hình thành biofilm của B. subtilis được phân lập.
a, Ảnh hưởng của pH tới tăng trưởng và hình thành biofilm của B. subtilis
Mơi trường tăng sinh B. subtilis được chọn là LB với các nồng độ pH được chuẩn bị từ 2 – 10. Các ống nghiệm cĩ chứa mơi trường LB cĩ thể tích xác định được điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1M và HCl 1M với bước nhảy là 0.5. Sau khi các ống nghiệm chứa mơi trường LB đã được điều chỉnh pH đem đi tiệt trùng và tiến hành cho thêm vào thể tích xác định dịch B. subtilis. Các ống nghiệm được tăng sinh trong vịng 24 giờ ở nhiệt độ 37 oC và lắc ở 130 rpm. Sau 24 giờ, hỗn hợp trong ống nghiệm được đo OD600 để xây dựng đồ thị tăng trưởng của B. subtilis theo độ pH. Dung dịch cịn lại trong các ống nghiệm được cất vào tủ ủ ở nhiệt độ 37oC trong vịng 5 ngày để đánh giá khả năng tạo biofilm của B. subtilis. Sau 5 ngày, màng sinh học được thu nhận, làm khơ và ghi lại khối lượng của từng màng. Cũng 1 dãy thí nghiệm như vậy, màng biofilm lại được thu hoạch, hồ tan lại trong nước pepton và được xác định số vi khuẩn bằng phương pháp trãi đĩa thạch petri trên mơi trường LB (Hình 2.6). Trong quá trình làm thí nghiệm này, các ống
nghiệm chứa mơi trường LB khơng cho khuẩn được sử dụng làm mẫu đối chứng.
Hình 2.6 Phương pháp xác định vi khuẩn trong biofilm bằng cách pha lỗng trãi lên mơi trường LBA, xác định mật độ vi khuẩn CFU/ml
b, Ảnh hưởng của nồng độ muối tới tăng trưởng và hình thành biofilm của B. subtilis
Để đánh giá khả năng sống sĩt trong mơi trường mặn, chuỗi thí nghiệm tăng sinh B. subtilis trong các mơi trường LB với các nồng độ muối NaCl được cho thêm vào từ 1g L-1 đến 40g L-1
. Cách tiến hành tăng sinh và khả năng tạo thành biofilm của B. subtilis cũng được tiến hành như trên mục 2.4.6 a. Trong quá trình làm thí nghiệm này, các ống nghiệm chứa mơi trường LB khơng cho khuẩn được sử dụng làm mẫu đối chứng.
2.5 Phân tích hình ảnh cộng đồng vi khuẩn trong biofilm bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) hiển vi điện tử quét (SEM)
Nhằm tìm hiểu sự gắn kết các vi khuẩn trong màng sinh học, các màng sinh học hình thành trong ống nghiệm sau 5 – 7 này ủ trong điều kiện ở trên
phần 2.3.5, được thu hoạch sang các ống ependorf, các ống này được quấn biofilm để gửi đi chụp dưới kính hiển vi điện tử quét ở Viện vệ sinh dịch tể trung ương, số 01 Yecxanh, Hà Nội. Các bước tiến hành được mơ tả trong bài báo đã được cơng bố vào năm 2020 của tác giả Nguyễn Thị Đơng Phương và các cộng sự[27].
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus từ mẫu biofloc vi tảo được nuơi trong nước thải thủy hải sản nước thải thủy hải sản
3.1.1. Phân lập vi khuẩn
Với phương pháp phân lập vi khuẩn được nêu trong phần nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Vi khuẩn được thu nhận mang đi kiểm tra hố sinh (Hình 3.1).