- Lấy 100µl huyền phù đã pha lỗng và trải lên đĩa thạch rồi ủ 24 giờ ở nhiệt độ mơi trường cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn cụ thể. Nếu số khuẩn lạc nhiều hơn 300, cần tiến hành pha lỗng tiếp tục. Đếm số khuẩn lạc và tạo đường chuẩn so với các giá trị OD đo được ở trên. Một đường thẳng
tuyến tính và phương trình là y = ax + b (với y, x là OD600 hoặc CFU/ml) được vạch theo số liệu thu được. Bằng cách thiết lập đường chuẩn này, và cĩ thể giả định mật độ/số lượng vi khuẩn bằng cách chỉ đo giá trị OD.
2.4.5 Xác định khả năng hình thành biofilm
Khả năng sản sinh màng sinh học của B. subtilis phân lập được thực hiện trong các ống nghiệm.
Nuơi cấy mẻ gốc (stater culture): B. subtilis (đã được phân lập và đánh số bởi ngân hàng Genome NCBI) được nuơi cấy trong mơi trường LB ủ ở 37oC ở 150 vịng/phút trong 5 giờ cho tới khi kiểm sốt được mật độ quang OD600 đạt gía trị 1,0[16]. Mơi trường LB được củng cố bằng cách thêm 1,5% (w/v) agar để thu được LBA.
- Thí nghiệm tạo màng sinh học: đối với màng sinh học trên mơi trường rắn, tiến hành hút 5µl dịch từ mẻ gốc được đặt trên các đĩa thạch đã chứa mơi trường LBA. Các đĩa được ủ ở 30o
C trong khoảng thời gian từ 5 – 7 ngày. Hình ảnh của màng sinh học cĩ kích thước khác nhau được chụp cứ sau 24 giờ sử dụng máy ảnh kĩ thuật số Sony A6300[37]. Kích thước màng được đo hằng ngày cho tới khi khơng đổi. Đối với màng sinh học hình thành trong mơi trường lỏng, hút 1ml dịch từ mẻ gốc cho vào ống nghiệm thuỷ tinh đã chứa 9ml LB đã được tiệt trùng. Sau đĩ, các ống nghiệm được nuơi qua đêm trên máy lắc 130 rpm nhằm tăng sinh tạo dịch huyền phù. Sau một đêm cấy, các ống nghiệm được đem đi ủ ở cùng điều kiện với màng sinh học trên mơi trường rắn (Hình 2.5).