Hình 3 .2 Taxanomy của các chủng được định danh
Hình 3.8 Mật độ vi khuẩn Bsubtilis trong lớp màng sinh học
y = -0.0295x3+ 0.5086x2- 2.4485x + 3.5612 R² = 0.9841 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 2 4 6 8 10 12 pH M ật đ ộ tế b ào , 1 0 8CFU /m l )
Cũng cùng với thí nghiệm đo mật độ vi khuẩn, các thí nghiệm hình thành trên màng sinh học trên bề mặt rắn LBA cũng được tiến hành, các tiến hành cũng được thực hiện như trên nhưng mơi trường LBA cũng được điều chỉnh pH từ 3 – 10. Kết quả biofilm được đo lường bằng cách đo đường kính màng sinh học hình thành cho tới khi đường kính này khơng đổi. Kết quả của việc thực hiện việc sản xuất màng sinh học trên bề mặt rắn được thể hiện trong Bảng 3.3.
Bảng 3.3 Sự hình thành màng sinh học theo sự thay đổi pH mơi trường dinh dưỡng pH Đường kính (mm) 3 - 4 - 5 16.5±0.2 6 23.0±0.3 7 27.3±0.3 8 26.4±0.5 9 11.9±0.3 10 3.3±0.2
Dựa vào bảng trên, cĩ thể thấy rằng với ở mơi trường cĩ pH lớn thì quá trình sản xuất màng sinh học bị ức chế với đường kính của màng trên bề mặt mơi trường thạch rắn nhỏ dần. Tương tự, các số liệu này mơ tả sự tương đồng với kết quả hình 3.8 với mật độ vi khuẩn B. subtilis thưa dần trong lớp màng sinh học. Tuy nhiên, khi so sánh với pH 5 – 6, sự phát triển của màng sinh
học khơng mạnh mẽ bằng pH 7 – 8. Sự mở rộng sản xuất màng sinh học thích hợp ở mơi trường cĩ pH lớn hơn 6 và vượt quá pH 8 thì việc nới rộng đường kính màng sinh học giảm dần. Các nghiên cứu đã được cơng bố trên thế giới về yếu tố ảnh hưởng của pH tới việc sản xuất màng sinh học được thực hiện bởi nhiều loại vi khuẩn khác nhau. Harjai và cộng sự đã mơ tả quá trình sản xuất màng sinh học ở P. aeruginosa ở pH 8 cao hơn ở pH 5 – 6, điều này họ giải thích là do sản xuất alginate cao hơn[40]. Heyde và cộng sự đã mơ tả rằng sự mở rộng của porin ở màng ngồi của thành tế bào vi khuẩn ở pH cao hơn cĩ thể gĩp phần vào sự tích tụ carbon và do đĩ, tổng hợp alginate cao hơn[41]. Mối liên quan tương tự giữa tăng pH và sản xuất màng sinh học cũng được chứng minh ở S. Maltophilia[25]. Mặt khác, mối quan hệ giữa pH của mơi trường dinh dưỡng và sản xuất màng sinh học cho thấy mối tương quan thuận ở tất cả các chủng thử nghiệm. Mơi trường sống tự nhiên với các yếu tố căng thẳng của mơi trường dường như đĩng một vai trị ít quan trọng hơn trong việc sản xuất màng sinh học so với nền tảng di truyền của vi sinh vật. Trong một thử nghiệm khác trên chủng Bacillus cereus (B. cereus) đã được phát triển trong điều kiện sản xuất ra màng sinh học và độ pH của mơi trường tăng trưởng được đo trong 24 giờ hình thành màng sinh học. Khi B. cereus được nuơi trong TSB bổ sung 1% glucose, độ pH của mơi trường tăng trưởng giảm xuống pH 4,5 trong khoảng thời gian 24 giờ. Ngược lại, trong trường hợp khơng cĩ glucose, mặc dù ban đầu cĩ một sự sụt giảm nhỏ đến pH, nhưng pH cuối cùng thích hợp là 6,5. Vì sự hình thành màng sinh học cĩ liên quan đến việc cung cấp glucose, nghiên cứu kết luận rằng ở mơi trường pH thấp gĩp rất ít phần vào khả năng của B. cereus để hình thành màng sinh học trong TSB[34]. Lee và cộng sự nghiên cứu khả năng tối thiểu của việc tổng hợp EPS liên quan đến sự thay đổi hình thái của các tế bào
luận khoảng pH tối ưu của mơi trường để sản xuất màng sinh học dao động trong khoảng 5,5 đến 6,5[52].
3.3.2 Xác định sự ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự phát triển và hình thành biofilm của B. subtilis được phân lập hình thành biofilm của B. subtilis được phân lập
Bên cạnh độ pH, nồng độ muối của mơi trường dinh dưỡng cũng ảnh hưởng đến khả năng hình thành màng sinh học. Thật vậy, với những thí nghiệm được xây dựng trên nền tảng thay đổi độ pH của mơi trường nuơi cấy KL12, những thí nghiệm thay đổi nồng độ NaCl của mơi trường LB cũng được thực hiện với sự cố định nồng độ pH 7,0 ± 0,5. Nghiệm thức của chuỗi thí nghiệm này là nồng độ NaCl được cho vào mơi trường LB từ 0,5% đến 4,0% (w/v). Kết qủa thể hiện ở Hình 3.9. đã cho thấy rằng B. subtilis được phân lập từ lớp EPS cĩ thể tồn tại trong mơi trường khắc nghiệt với nồng độ muối lên đến 40 g/L (nồng độ muối lớn hơn nồng độ muối trong nước biển). Với việc phân tích mật độ tế bào vi khuẩn cĩ trong cấu trúc màng sinh học cho thấy sự thay đổi nồng độ muối khơng làm thay đổi mật độ KL12 trong cấu trúc màng sinh học ngoại trừ mơi trường chuẩn LB cĩ nồng độ 10g NaCL/L cĩ mật độ tế bào lớn nhất.
Hình 3.9 Sự thay đổi của nồng độ muối ảnh hưởng đến việc sản xuất màng sinh học của chủng B. subtilis MT300402.
Nồng độ muối (g NaCL L-1
Độ mặn của đất chủ yếu do NaCl của các vùng đất nơng nghiệp được coi là một trong những mối đe dọa lớn đối với năng suất cây trồng trong đĩ cĩ lúa mì. Ở mức độ mặn cao, sự tích tụ của các ion Na+
dẫn đến thay đổi các đặc tính hĩa lý của đất như giảm độ xốp của đất, độ thống khí của đất và độ dẫn nước và điều này ảnh hưởng đến sự hấp thụ dinh dưỡng của cây từ đất và sức khỏe tổng thể của đất[42]. Các tác động cĩ hại của độ mặn đối với các đặc điểm sinh trưởng của lúa mì như sự khởi đầu của bơng lúa, số lượng xới đất, sự hình thành các bơng và kích thước hạt, quá trình nở hoa bị chậm và các tiêu hao sinh lý đã được ghi nhận rõ ràng. Cũng theo nghiên cứu của Ansari và cộng sự cơng bố năm 2019 về mức độ ảnh hưởng của độ mặn trong đến sự hình thành màng sinh học bao bọc xung quanh của rễ cây[5]. Ảnh hưởng của nồng độ muối từ 75 đến 500mM đã được nghiên cứu đến sự phát triển của màng sinh học trong các bề mặt tấm microtitre, bề mặt thủy tinh và bề mặt rễ. Ở nồng độ xử lý NaCl thấp hơn (125 và 250mM), cĩ sự tăng cường phát triển màng sinh học lần lượt là 21,2 và 30,5%. Tương tự, cường độ của màng sinh học hình thành trên bề mặt rễ giảm mạnh khi cĩ mặt 500mM NaCl, thể hiện rõ từ hình ảnh dưới kính hiển vi điện tử. Tuy nhiên, cường độ màng sinh học đã tăng lên ở nồng độ 125 và 250mM khi khơng cĩ sự kiểm sốt, cho thấy phản ứng điều biến phụ thuộc nồng độ của NaCl. Nhìn chung, các đặc điểm sinh trưởng của thực vật giảm khi nồng độ NaCl tăng (Bảng 3.4). Nồng độ NaCl tăng lên dẫn đến chiều dài của các cây khơng được tiêm chủng ngày càng giảm dần. Chiều dài rễ giảm tối đa được ghi nhận ở nồng độ NaCl cao nhất được thử nghiệm. Việc sử dụng NaCl ở các nồng độ khác nhau (75, 125 và 250mM trong đất) làm giảm chiều dài rễ tương ứng 33, 48 và 51% so với cây đối chứng khơng được cấy. Ngược lại, Bacillus sp. FAB10 được cấy vào trong đất được xử lý với liều lượng NaCl như trên cĩ tốc độ phát triển rễ lớn hơn so với cây khơng được cấy. Ở các cây được xử lý bằng NaCl, chế phẩm
sinh học đã tăng cường chiều dài rễ lên đáng kể 36,2, 52,7 và 57% ở 75, 125 và 250mM tương ứng.
Màng sinh học sản xuất theo nồng độ muối cũng được tiến hành thử nghiệm trên mơi trường LBA như trong điều kiện thay đổi pH. Kết quả của Bảng 3.4. cũng thể hiện tương tự sự ảnh hưởng của NaCl tới sự hình thành màng sinh học của khuẩn KL12.
Bảng 3.4. Sự ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự sản xuất màng sinh học của KL12 Nồng độ muối (g NaCl L-1) Đường kính (mm) 5 19.8±0.6 10 29.8±0.5 15 17.2±0.2 20 14.3±0.6 25 12.2±0.5 30 12.9±0.1 35 11.9±0.2 40 12.0±0.2
Sự giới hạn về đường kính màng sinh học của KL12 trên mơi trường rắn LBA khi tăng dần nồng độ muối từ 15g/L thể hiện rõ hơn sự ức chế sản xuất màng so với mơi trường lỏng. Các nghiên cứu khác cũng cho thấy sự hình thành màng sinh học bị ảnh hưởng bởi cường độ ion của mơi trường. Cường độ ion của mơi trường (ví dụ, dung dịch đất) thay đổi hành vi của vi khuẩn.
Cường độ ion ngày càng tăng trong dung dịch gây ra ứng suất mặn, cĩ thể kích thích vi sinh vật bám dính bề mặt và sau đĩ hình thành màng sinh học[45]. Muối được tạo thành bởi các ion hĩa trị một (NaCl) hoạt động như một tác nhân phân tán, trong khi muối chứa ion hĩa trị hai (CaCl2) được coi là một tác nhân tăng cường sự kết tụ[57]. Các cation hĩa trị hai (Ca2+
và Mg2+) liên kết chất nền ngoại bào tích điện âm bằng cơ chế bắc cầu[50]. Các ion kim loại nặng độc hại (Cd2+
và Pb2+) liên kết mạnh hơn với chuỗi xanthan và hyaluronate so với các cation sinh học nhẹ hơn (Ca2+
và Mg2+)[8]. Các báo cáo trên cho thấy vai trị của cường độ ion cũng như hĩa trị ion là những yếu tố quan trọng trong việc vận dụng sự phát triển màng sinh học đến những hậu quả thực tế tiềm tàng đối với cơng nghệ sinh học và y học. Một số nghiên cứu đã phân lập những vi khuẩn cĩ khả năng sống sĩt trong mơi trường đất nhiễm mặn để nghiên cứu hành vi của chúng sống trong mơi trường đĩ là gì. Do đĩ, khả năng sống trong màng sinh học của nĩ cĩ thể rất cần thiết trong quá trình phong hĩa mặt chứa các khống chất photphat. Wang và cộng sự phân lập
Brevundimonas viscosa từ đất mặn[78] và Fritz và cộng sự báo cáo rằng natri clorua ở nồng độ lên đến 3% thúc đẩy sự phát triển của Brevundimonas mediterranea[33]. Trong thí nghiệm của họ, mật độ Brevundimonas dồi dào nhất được quan sát thấy ở nồng độ trung gian của cả hai muối tương đương 30mM MgSO4 (2,8% w/v) và 30mM KCl (1,1% w v). Trong khi đĩ, các số liệu thu được của nghiên cứu này đã chứng minh được rằng B. subtilis phân lập được EPS cĩ nguồn gốc từ nước thải thuỷ hải sản cĩ thể sống sĩt trong điều kiện muối lên đến 4% (w/v).
KẾT LUẬN
- Đã tuyển chọn được 03/12 chủng Bacillus subtilis phân lập từ hợp chất polime ngoại bào. Đĩ là các chủng B. subtilis MT300402, B. subtilis
MT300403 và B. subtilis MT300404 được giữ ở ngân hàng genome và khảo sát được khả năng kháng khuẩn của các chủng B. subtilis mới được tuyển chọn và cho kết quả tương tự với dịng vi khuẩn từ đất.
- Thử nghiệm và xác định được chủng B. subtilis MT300402 cĩ khả năng sinh biofilm của trong cả mơi trường lỏng và rắn. Từ đĩ, khảo sát ảnh hưởng của độ pH và nồng độ muối đến sự phát triển và hình thành biofilm của
B. subtilis đã được tuyển chọn. Cụ thể:
+ Độ pH: B. subtilis MT300402 cĩ khả năng sản xuất màng sinh học ở mơi trường cĩ pH trong khoảng pH từ 6,5 – 8,0.
+ Nồng độ muối: B. subtilis MT300402 cĩ thể sống sĩt trong điều kiện muối lên đến 4% (w/v).
KIẾN NGHỊ
Những thơng tin trong luận văn là nền tảng cần thiết trong mục tiêu tiếp tục phát triển, mở rộng các nghiên cứu đến khả năng sinh biofilm của các chủng B. subtilis.
Trong thời gian tới, đề nghị tiếp tục nghiên cứu, xác định gen mã hĩa hình thành biofilm cũng như xác định thành phần mơi trường dinh dưỡng lý tưởng cho việc hình thành biofilm của các chủng B. subtilis phân lập được từ nước thải thủy hải sản. Từ đĩ ứng dụng vào sản xuất thực tế. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
[1] N. N. Ngọc, V. Cách, and N. T. Diệp, “PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN Bacillus BẢN ĐỊA CĨ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI CHẤT HỮU CƠ TRONG NƯỚC THẢI LÀNG NGHỀ CHẾ BIẾN TINH BỘT DONG RIỀNG.”
[2] Văn Phúc, N., Thị, P., & Trang, P. (2014). Tạp chí khoa học ĐHSP TPHCM phân lập, định danh và xác định các đặc tính cĩ lợi của chủng
Bacillus spp. từ ao nuơi tơm ở tỉnh Bến Tre.
[3] Yến, L. T. H., & Hiền, N. Đ. (2016). Khảo sát đặc tính probiotic các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập tại các tỉnh Đồng bằng sơng Cửu Long. Can Tho University Journal of Science, Nơng nghiệp 2016, 26.
https://doi.org/10.22144/ctu.jsi.2016.040
Tiếng Anh
[4] Andretta, C. W. S., Rosa, R. M., Tondo, E. C., Gaylarde, C. C., & Henriques, J. A. P. (2004). Identification and molecular characterization of a Bacillus subtilis IS13 strain involved in the biodegradation of 4,5,6- trichloroguaiacol. Chemosphere, 55(4), 631–639.
https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2003.11.062
[5] Ansari, F. A., Ahmad, I., & Pichtel, J. (2019). Growth stimulation and alleviation of salinity stress to wheat by the biofilm forming Bacillus pumilus strain FAB10. Applied Soil Ecology, 143, 45–54.
https://doi.org/10.1016/j.apsoil.2019.05.023
[6] Bais, H. P., Fall, R., & Vivanco, J. M. (2004). Biocontrol of Bacillus subtilis against Infection of Arabidopsis Roots by Pseudomonas syringae
Is Facilitated by Biofilm Formation and Surfactin Production. Plant Physiology, 134(1), 307–319. https://doi.org/10.1104/pp.103.028712 [7] Beauregard, P. B., Chai, Y., Vlamakis, H., Losick, R., & Kolter, R.
(2013). Bacillus subtilis biofilm induction by plant polysaccharides.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 110(17). https://doi.org/10.1073/pnas.1218984110
[8] Bergmann, D., Furth, G., & Mayer, C. (2008). Binding of bivalent cations by xanthan in aqueous solution. International Journal of Biological Macromolecules, 43(3), 245–251.
https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2008.06.001
[9] Boon, N., Goris, J., De Vos, P., Verstraete, W., & Top, E. M. (2000). Bioaugmentation of activated sludge by an indigenous 3-chloroaniline- degrading Comamonas testosteroni strain, I2gfp. Applied and Environmental Microbiology, 66(7), 2906–2913. https://doi.org/10.1128/AEM.66.7.2906-2913.2000
[10] Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., & Kolter, R. (2006). A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix.
Molecular Microbiology, 59(4), 1229–1238. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2005.05020.x
[11] Branda, S. S., González-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., & Kolter, R. (2001). Fruiting body formation by Bacillus subtilis.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 98(20), 11621–11626. https://doi.org/10.1073/pnas.191384198 [12] Briandet, R., Meylheuc, T., Maher, C., & Bellon-Fontaine, M. N. (1999).
Listeria monocytogenes Scott A: Cell surface charge, hydrophobicity, and electron donor and acceptor characteristics under different environmental
growth conditions. Applied and Environmental Microbiology, 65(12), 5328–5333. https://doi.org/10.1128/aem.65.12.5328-5333.1999
[13] Cairns, L. S., Hobley, L., & Stanley-Wall, N. R. (2014). Biofilm formation by Bacillus subtilis: New insights into regulatory strategies and assembly mechanisms. In Molecular Microbiology (Vol. 93, Issue 4, pp. 587–598). Blackwell Publishing Ltd. https://doi.org/10.1111/mmi.12697 [14] Cerca, N. FEMS Microbiol Lett 283, pp. 36-41, 2008.
[15] Chagnot, C., Agus, A., Renier, S., Peyrin, F., Talon, R., Astruc, T., & Desvaux, M. (2013). In Vitro Colonization of the Muscle Extracellular Matrix Components by Escherichia coli O157:H7: The Influence of Growth Medium, Temperature and pH on Initial Adhesion and Induction of Biofilm Formation by Collagens I and III. PLoS ONE, 8(3).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0059386
[16] Chai, Y., Norman, T., Kolter, R., & Losick, R. (2011). Evidence that metabolism and chromosome copy number control mutually exclusive cell fates in Bacillus subtilis. EMBO Journal, 30(7), 1402–1413.
https://doi.org/10.1038/emboj.2011.36
[17] Characklis, W. G. (1973). Attached microbial growths-II. Frictional resistance due to microbial slimes. In Water Research (Vol. 7, Issue 9, pp. 1249–1258). Pergamon. https://doi.org/10.1016/0043-1354(73)90002- X (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
[18] Chavant, P., Martinie, B., Meylheuc, T., Bellon-Fontaine, M. N., & Hebraud, M. (2002a). Listeria monocytogenes LO28: Surface physicochemical properties and ability to form biofilms at different temperatures and growth phases. Applied and Environmental Microbiology, 68(2), 728–737.
https://doi.org/10.1128/AEM.68.2.728-737.2002
[19] Chavant, P., Martinie, B., Meylheuc, T., Bellon-Fontaine, M. N., & Hebraud, M. (2002b). Listeria monocytogenes LO28: Surface physicochemical properties and ability to form biofilms at different temperatures and growth phases. Applied and Environmental Microbiology, 68(2), 728–737.
https://doi.org/10.1128/AEM.68.2.728-737.2002
[20] Chen, Y., Cao, S., Chai, Y., Clardy, J., Kolter, R., Guo, J. H., & Losick, R. (2012). A Bacillus subtilis sensor kinase involved in triggering biofilm formation on the roots of tomato plants. Molecular Microbiology, 85(3), 418–430. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2012.08109.x
[21] Chen, Y., Yan, F., Chai, Y., Liu, H., Kolter, R., Losick, R., & Guo, J. H. (2013). Biocontrol of tomato wilt disease by Bacillus subtilis isolates from natural environments depends on conserved genes mediating biofilm formation. Environmental Microbiology, 15(3), 848–864.
https://doi.org/10.1111/j.1462-2920.2012.02860.x
[22] Costerton, W., Veeh, R., Shirtliff, M., Pasmore, M., Post, C., & Ehrlich, G. (2003). The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections. Journal of Clinical Investigation, 112(10), 1466–1477. https://doi.org/10.1172/jci20365
[23] De Weger, L. A., van Der Vlugt, C. I. M., Wijfjes, A. H. M., Bakker, P.