4. Bố cục đề tài
3.1.2Đánh giá khả năng đối kháng của B subtilis với E Coli
a, Xác định tính đối kháng của B. subtilis phân lập với E. Coli
Với phương pháp đánh giá kháng khuẩn được nêu trong phần phương pháp nghiên cứu, các khuẩn lạc KL12, KL13 và KL14 được tiến hành thử nghiệm tính đối kháng của chúng với chủng E. coli ATCC25922. Kết quả được thể hiện trên Hình 3.3 như sau:
Hình 3.3 Khả năng kháng khuẩn của B. subtilis phân lập đối kháng
E. coli ATCC25922
LB: mơi trường; DW: nước cất; Blank: để trống.
Với kết quả thể hiện trên Hình 3.3 và đo đạt đường kính vùng ức chế vi khuẩn đối kháng, KL12, KL13 và KL14 cho khả năng kháng khuẩn với E. coli ATCC25922 với đường kính vùng ức chế 15,2 ± 0,3 mm. Kết quả này cho thấy rằng, B. subtilis được phân lập từ mơi trường khác khơng phải từ đất như các cơng trình nghiên cứu khác cũng cho khả năng kháng khuẩn tương tự.
Ví dụ, B. subtilis KKU213 được phân lập từ đất sâu khác 30cm và hoạt chất sinh học thơ trong B. subtilis KKU213 CFS thể hiện hoạt tính kháng khuẩn chống lại một số vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là các mầm bệnh truyền qua thực phẩm như B. cereus, S. aureus và L. monocytogenes. Do bản chất là sinh vật sống trong đất, B. subtilis KKU213 cĩ khả năng chịu được mơi trường khắc nghiệt và tạo ra các loại hợp chất chứa các chất kháng khuẩn
KL12 DW Blank LB KL13 Blank LB DW KL14 LB Blank DW
như vi khuẩn, lipopeptit và kháng sinh để chống lại các vi sinh vật cạnh tranh trong đất là khơng đáng ngạc nhiên[48] [49]. Hoạt động sản xuất và ức chế của vi khuẩn do Bacillus.sp sản xuất, cịn phụ thuộc vào mơi trường, nhiệt độ, thời gian ủ và kỹ thuật được sử dụng để phát hiện. Đối với KKU213, mơi trường LB phù hợp hơn mơi trường BHI để sản xuất và kích hoạt hoạt động của bacteriocin. BHI là một mơi trường tăng trưởng cĩ giá trị dinh dưỡng cao so với LB. Do đĩ, LB cĩ thể giải định các điều kiện mơi trường cơ bản và thiết yếu, chẳng hạn như khi cạnh tranh với các vi sinh vật khác trong mơi trường, và do đĩ cĩ thể khiến chủng KKU213 tạo ra nhiều chất kháng khuẩn hơn trong mơi trường nuơi cấy. Trong hầu hết các trường hợp, sản xuất bacteriocin phụ thuộc vào tốc độ tăng trưởng và thường bắt đầu trong giai đoạn giữa log và đạt đỉnh điểm ở giai đoạn chuyển tiếp giữa pha log và pha tĩnh[81].
b, So sánh tính đối kháng của B. subtilis phân lập từ lớp ngoại bào và B. subtilis phân lập từ đất
Cũng tương tự với cách thực hiện như phần 3.1.2.a, nhưng trong phần này sự so sánh tính đối kháng E. coli ATCC25922 được thực hiện trên đối tượng B. subtilis phân lập từ nghiên cứu này và B. subtilis cĩ nguồn gốc từ đất. B. subtilis BSB1 được mua giống trên Sigma Aldrich và đã được cất trữ ở -20oC, tại phịng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật. Các giống này trước khi bước qua các thử nghiệm tính kháng khuẩn, được tăng sinh trong mơi trường LB cho tới khi đạt được OD600 xung quanh giá trị 1,0. Đối với thí nghiệm về sau, KL12 được lựa chọn là B. subtilis được phân lập và sử dụng cho nghiên cứu này. Phương pháp để đánh giá tính kháng khuẩn của B. subtilis phân lập từ nghiên cứu này và B. subtilis
cĩ nguồn gốc từ đất được thực hiện như trên. Kết quả Hình 3.4 cĩ thể cho thấy sự kháng khuẩn của B. subtilis cĩ kí hiệu KL12 và B. subtilis BSB1.
Hình 3.4 So sánh tính đối kháng của vi khuẩn B. subtilis phân lập từ EPS và B. subtilis cĩ nguồn gốc phân lập từ đất
8: Vịng ức chế sinh ra bởi KL12; 8s: Vịng ức chế sinh ra bởi B. subtilis BSB1; 8: Mơi trường LB; Nc: nước cất tiệt trùng; 11 và 11’:
khơng đề cập.
Cĩ thể thấy rằng dịng phân lập KL12 cĩ khả năng kháng khuẩn được xác định dựa trên các đặc điểm kiểu hình, sinh hĩa và kiểu gen (chuỗi gen 16S rRNA) tương tự với dịng vi khuẩn từ đất. Kết quả của nghiên cứu này phù hợp với các nghiên cứu được thực hiện bởi Al-Ajlani và Hasnain, trong đĩ các phân lập vi khuẩn đất từ đất Punjab (Pakistan) được xác định là B. subtilis trên cơ sở phân tích trình tự gen 16S rRNA hình thái, sinh hĩa và kiểu gen (chuỗi gen 16S rRNA) tương [63]. Ảnh hưởng của các thơng số khác nhau được phân tích lên sự phát triển và sản xuất các chất chuyển hĩa kháng khuẩn trong mơi trường TSB, vùng ức chế tối đa (15 ± 0,05 mm) được quan sát đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị ở pH 8, nhiệt độ 30 °C sau 48 giờ ủ với chế độ rung lắc. Yun và các đồng nghiệp của ơng đã tối ưu hĩa việc sản xuất các chất chuyển hĩa cĩ hoạt tính sinh học thơng qua phương pháp luận bề mặt
phản ứng và đạt được sản lượng chất chuyển hĩa tối ở 29,97°C [82], và với kết quả kháng khuẩn của B. subtilis từ đất của nhĩm nghiên cứu này cũng cĩ những kết quả tương đồng.