4. Bố cục đề tài
1.3.4Tính chất bề mặt giá thể
Đây là yếu tố quyết định đến việc hấp thụ chất hữu cơ và bám dính của tế bào bởi vậy mỗi lồi vi khuẩn chỉ hình thành màng sinh vật trên một số loại bề mặt với tính chất nhất định.
Sự phát triển của các tế bào bên trong màng sinh vật đã được chứng minh là cĩ tăng lên khi tăng mức độ thơ ráp của bề mặt. Characklis và cộng sự đã ghi nhận mức độ bám dính của khuẩn lạc vi sinh vật gia tăng khi các bề mặt càng ghồ ghề[17]. Điều này được giải thích là do ở bề mặt thơ nhám,
lực tương tác giữa các tế bào với bề mặt giảm đi và diện tích tiếp xúc được tăng lên đáng kể so với các bề mặt trơn nhẵn.
Tính chất hĩa lý của bề mặt vật liệu cũng ảnh hưởng mạnh mẽ đến tốc độ và mức độ bám dính của tế bào lên bề mặt. Hầu hết các nghiên cứu cho thấy rằng các vi sinh vật gắn kết với một bề mặt kị nước, khơng phân cực như Teflon và nhựa nhanh hơn và tốt hơn so với bề mặt một vật liệu ưa nước như thủy tinh hay kim loại[32].
Nghiên cứu về màng sinh vật đã và đang là lĩnh vực thu hút sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học, giúp chúng ta hiểu rõ hơn về tác hại cũng như lợi ích ứng dụng của màng sinh vật trong đời sống. Tuy nhiên, các nghiên cứu chủ yếu thu nhận được từ các cơng trình khoa học nước ngồi. Tài liệu về màng sinh vật ở Việt Nam cịn tương đối ít và nghiên cứu về màng sinh vật cịn chưa nhiều, chưa sâu. Đề tài nghiên cứu của chúng tơi với mục đích tạo thêm cơ sở dữ liệu khoa học về các yếu tố ảnh hưởng tới sự hình thành màng sinh học của B. subtillis phân lập từ EPS.
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU 2.1 Đối tượng
Biofloc vi tảo: được thu hoạch từ bể nuơi vi tảo Chlorella vulgaris 911 trong nước thải thủy hải sản tại phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học – Khoa Cơng nghệ Hố học – Mơi trường, trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật, Đại học Đà Nẵng và lưu trữ ở 4oC trong tủ lạnh chuẩn bị cho các bước thí nghiệm tiếp theo.
Polime ngoại bào (EPS): được chiết xuất từ các biofloc này được sử dụng làm nguyên liệu để phân lập B. subtilis với phương pháp chiết được mơ tả ở dưới đây.
2.2 Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Phân lập Bacillus từ hợp chất polime ngoại bào được chiết xuất từ biofloc vi tảo nuơi trong nước thải thuỷ hải sản.
1.1. Chiết xuất EPS từ bioflocvi tảo 1.2. Phân lập vi khuẩn Bacillus
1.3. Xác định đặc tính sinh hĩa các khuẩn lạc Bacillus nghi ngờ.
1.4. Định danh vi khuẩn Bacillus nghi ngờ, xác định khuẩn B. subtilis kí gửi ngân hàng Genome NCBI.
1.5. Đánh giá khả năng đối kháng của B. subtilis
- Xác định tính đối kháng của B. subtilis với khuẩn E. coli.
- So sánh tính đối kháng của B. subtilis phân lập từ lớp ngoại bào và B. subtilis phân lập từ đất.
Nội dung 2: Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và hình
2.1. Xác định đặc tính sinh biofilm của B. subtilis phân lập.
2.2. Xác định sự ảnh hưởng của pH và nồng độ muối đến sự phát triển và hình thành biofilm của B. subtilis được phân lập.
- Xác định sự ảnh hưởng của pH đến sự phát triển và hình thành biofilm của B. subtilis được phân lập.
- Xác định sự ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự phát triển và hình thành biofilm của B. subtilis được phân lập.
2.3 Hĩa chất, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
2.3.1 Hĩa chất
Hĩa chất và mơi trường nuơi cấy vi sinh vật:
- Hĩa chất: Pepton (Merck, Việt Nam), Trypton (Merck, Việt Nam), cao nấm men (Merck, Việt Nam), tinh bột, muối (NaCl).
- Mơi trường nuơi cấy vi sinh vật:
+ LB (Luria Bertani) gồm: 1% tryptone; 0,5% (w/v) cao nấm men; 1,0% NaCl.
+ LBA: 1% trypton; 0,5% (w/v) cao nấm men, 1,0% (w/v) NaCl và 1,5% agar (w/v).
+ SA (Starch agar) bao gồm: tinh bột 10g/l, peptone 5g/l, NaCl 0,5g/l, agar: 15g/l.
2.3.2 Dụng cụ, thiết bị (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dụng cụ, thiết bị thực hiện đề tài được liệt kê trong phần phụ lục.
2.4 Phương pháp pháp nghiên cứu
2.4.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ mẫu biofloc vi tảo được nuơi trong nước thải thủy hải sản. nuơi trong nước thải thủy hải sản.
a, Chiết xuất
Mẫu biofloc được lấy 1 lần/ngày vào lúc 8 giờ 30 phút sáng và mỗi lần lấy 2ml. Mẫu tảo được đựng trong hộp đựng mẫu và mang đi lọc, rửa với nước cất 1 lần trước khi trãi qua các bước chiết xuất EPS.
* Phương pháp chiết xuất EPS từ biofloc vi tảo
Phương pháp chiết xuất EPS từ biofloc đã được lọc rửa được mơ tả theo tài liệu đã được cơng bố năm 2020 của nhĩm tác giả Nguyen và cộng sự [27].
EPS cĩ ít nhất hai lớp bao bọc vi tảo trong ma trận biofloc, vì thế để kiểm sốt dấu hiệu tồn tại của EPS, sự phân tách hồn tồn của các tế bào vi tảo bị tách ra khỏi nhau bằng cách sử dụng kính hiển vi điện tử (Zeiss, Fisher Scientific UK). Lớp đầu tiên cĩ tên LB-EPS, là lớp ngồi cùng nằm trong màng sinh học được chiết xuất từ huyền phù vi tảo. Biofloc được thu thập từ quá trình nuơi cấy bằng cách lọc, sau đĩ rửa bằng nước ấm khử ion (DW) và được vortex trong 1 phút. Sau đĩ, biofloc được ủ trong một cốc cách thuỷ và lắc với 120 vịng/phút ở 30oC trong một giờ. Lúc này, các tế bào vi tảo nên được kiểm tra bằng kính hiển vi để xem xét sự phân tách một phần khỏi nhau bởi kết dính EPS. Sau đĩ, phần nổi phía trên là lớp LB-EPS được thu nhận bằng cách ly tâm hổn hợp trên ở 5000 vịng và trong 20 phút lúc 4o
C. Trong khi phần nổi phía trên được thu thập bằng phương pháp lọc sử dụng giấy Whatman 0,45 µm, sấy khơ, cân và bảo quản ở - 20oC để sử dụng cho các quá trình phân lập vi khuẩn sau này.
Trong khi đĩ cặn của quá trình li tâm được tiếp tục hồ tan lại trong 0,1M EDTA với thể tích xác định để tiếp tục chiết lớp trong cùng của màng sinh học (TB-EPS). Hỗn hợp được ủ trong cốc cách thủy và lắc như được sử dụng trong phần chiết LB-EPS trong 4 giờ. Tương tự như vậy, các tế bào vi tảo trong bước này được phân tích bằng kính hiển vi để đảm bảo rằng khơng cĩ tế bào nào bị kết dính với nhau hoặc hồn tồn tách rời nhau. Để thu thập dịch chiết TB-EPS trong phần nổi phía trên, phương pháp ly tâm được sử
dụng ở điều kiện 5000g trong 20 phút ở -4oC, lọc bằng giấy Whatman 0,45µm. Dung dịch khơng màu TB-EPS đạt được đã được sấy khơ, cân và bảo quản ở tủ lạnh sâu -20o
C.
b, Phân lập vi khuẩn B. subtilis
Phân lập vi khuẩn là phương pháp chủ yếu để tách các nhĩm vi sinh vật khác nhau. Đây là phương pháp cho phép chúng ta phân biệt các nhĩm vi khuẩn khác nhau dựa mơi trường nuơi cấy. Các vi khuẩn khác nhau phát triển khác nhau trên các mơi trường dinh dưỡng khác nhau, tùy thuộc vào nhu cầu phát triển của chúng và các yếu tố khác như nhiệt độ, pH, lượng oxy sẵn cĩ, ... Phân lập vi khuẩn là một bước quan trọng để xác định và phân loại vi khuẩn.
Kỹ thuật phân lập vi khuẩn sử dụng một số phương pháp nuơi cấy và khơng nuơi cấy. Mẫu cĩ thể được nuơi cấy và phân lập từ mơi trường rắn, lỏng và mơi trường nuơi cấy lỏng tự động. Sự phát triển của vi khuẩn trong mơi trường nuơi cấy rắn và lỏng được đặc trưng bởi sự xuất hiện của các khuẩn lạc đặc trưng và độ đục. Cĩ 2 kỹ thuật phân lập vi khuẩn cơ bản là kỹ thuật cấy ria và cấy trang.
A B
Hình 2.1 Kỹ thuật phân lập: A) Kỹ thuật cấy ria; B) Kỹ thuật cấy trang.
Mẫu chứa hổn hợp vi khuẩn
Ria que cấy trên mơi trường nuơi cấy dạng rắn
Các dạng ria
Dịch chứa VSV
Mẫu được hút cho lên mơi trường cấy dạng rắn
Trang mẫu
Khuẩn lạc mọc lên mơi trường
Hai kỹ thuật này được sử dụng trong đề tài này nhằm phân lập và làm thuần vi khuẩn cần phân lập. Trình tự tiến hành được thực hiện như sau: hút 0,1ml dịch EPS đã chiết xuất trãi lên các đĩa petri chứa mơi trường rắn LB agar (LBA), trang đều bằng que cấy rồi đem ủ các đĩa petri này ở nhiệt độ 37oC trong vịng 24 ± 2 giờ. Chọn các khuẩn lạc đặc trưng tương tự với hình thái của B. subtilis dạng trịn lớn kích thước 3 – 5 mm, răng cưa khơng đều, màu trắng đục, bề mặt nhăn nheo. Chọn các khuẩn lạc cĩ hình thái như thế cấy chuyển sang đĩa chứa mơi trường LBA, đánh số thứ tự, ghi rõ trên từng đĩa rồi đem ủ ở 37 ºC trong 24 giờ. Tiếp tục tách rịng cho đến khi thu được dịng thuần. Các dịng vi khuẩn phân lập được nuơi tăng sinh trong mơi trường LB. Sau đĩ trữ vi khuẩn với glycerol 20-25% và giữ ở -20oC trước khi phân tích tiếp.
2.4.2 Xác định tính chất sinh hĩa của B. subtilis nghi ngờ
Các chỉ tiêu sinh hĩa để định danh các dịng vi khuẩn phân lập được chọn theo Andretta và cộng sự[4].
Xác định tính di động, sản sinh catalase, sản sinh indole, phản ứng Voges-proskauer (VP), các phản ứng lên men đường glucose, nhuộm Gram thực hiện theo Sharmin and Rahman[72].
a, Thử nghiệm khả năng di động:
Cấy đâm sâu que cấy chứa vi khuẩn trong thạch mềm, khoảng 2/3 độ dài thạch. Ủ thạch từ 18-24h ở 37oC. Nếu vi khuẩn cĩ thể di động xung quanh đường cấy, xoắn ốc hoặc làm đục tồn bộ ống thạch. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
b, Thử nghiệm sản sinh catalase
Một giọt hydro peroxit 30% được đặt trên một phiến kính. Một vịng cấy vi khuẩn mới được lấy bằng que cấy vơ trùng và đặt trên giọt hydrogen peroxide. Hiện tượng xuất hiện bĩng khí cho thấy kết quả khả quang.
c, Thử nghiệm sản sinh indole
Lấy một vịng que cấy vi khuẩn mới (24 giờ tuổi) cấy vào mơi trường peptone và ủ ở 37°C trong 1-3 ngày, sau khi ủ, dung dịch Kovac được thêm vào và lắc mạnh trong một phút. Màu đỏ trên lớp thuốc thử cho thấy phản ứng dương tính.
d, Kiểm tra phản ứng Voges-proskauer (VP)
Thử nghiệm Voges Proskauer (VP) được thực hiện trên 1ml dịch cấy vi khuẩn tươi được nuơi trong mơi trường phosphate peptone. Sau khi thêm 0,2 ml KOH 40%, thêm 0,6 ml α-napthol 5% trong etanol nguyên chất. Sau 10-15 phút lắc mạnh, màu đỏ cam tươi sẽ phát triển nếu cĩ mặt acetyl metyl carbinol.
e, Nhuộm Gram
Nhỏ một giọt nước cất đã khử trùng vào giữa lam kính. Sau đĩ, chuyển 1 vịng que cấy vi khuẩn vào giọt nước đã khử trùng và trải đều thành một lớp. Mẫu được làm khơ bằng cách hơ qua ngọn lửa nhẹ hai hoặc ba lần. Nhỏ dung dịch thuốc tím ngập mẫu và để yên trong 30 giây rồi rửa kỹ bằng vịi nước chảy nhẹ. Sau đĩ, phiến kính được ngâm trong dung dịch iốt trong 1 phút và rửa kỹ bằng cồn 95% trong 10 giây. Cồn được xả sạch và rửa kỹ bằng vịi nước nhẹ. Sau đĩ, phủ safranin lên mẫu trong một phút. Sau khi rửa bằng nước máy và thấm khơ và kiểm tra dưới kính hiển vi.
f, Phản ứng lên men đường glucose
Thử nghiệm lên men trong mơi trường canh thang cĩ chứa đường, pepton và cao thịt (để cung cấp các dinh dưỡng phụ cho các vi sinh vật khĩ lên men), và chất chỉ thị mầu tía cresol brom (chất chỉ thị pH). Nếu cĩ sự lên men đường, thường sinh ra acid. Trường hợp này pH mơi trường giảm xuống đã làm cho màu tía cresol brom chuyển từ xanh sang vàng. Cũng như vậy, nếu
thêm ống Durham, sẽ cho phép xác định sự sinh hơi (H2) từ quá trình lên men. Kết quả trả lời cuối cùng là sinh acid (+/-) và gas (+/-).
2.4.3 Định danh
a, Phương pháp PCR
* Ly trích ADN: Phương pháp ly trích ADN dựa theo Boon[9]. * Chạy PCR
Các quá trình này được thực hiện ở viện Cơng nghệ Sinh học thành phố Huế.
b,Chạy điện di, đọc kết quả và sequencing
Quá trình điện di được thực hiện với dung dịch TAE 1X và bản thạch chứa 1,5% agarose.
Chuẩn bị bản thạch: Đun nĩng dung dịch agarose bằng lị vi sĩng cho tới khi agarose tan hồn tồn, để dung dịch nguội khoảng 50o
C. Cho ethidium bromide (2µl/100 ml dung dịch gel) vào khuấy đều. Sau đĩ đổ vào khay đã chuẩn bị trước (đổ sao cho bề dày của gel cao hơn đáy của lược gel khoảng 0,3-0,5 cm).
Khi gel đặc lại cho vào bồn điện di và thêm dung dịch TAE 1X vào cho vừa bao phủ gel. Dùng pipet hút 8µl mẫu cần phân tích trộn với 2µl Loading Dye 6X cho vào từng giếng. Sử dụng thang ADN (giới hạn 100 -1517 bp) để xác định khối lượng phân tử của sản phẩm PCR. Đối chứng âm được dùng là nước cất. Khi đã cho mẫu vào các giếng, nối bồn điện di với nguồn điện (50V) để chạy điện di. Ngừng dịng điện khi màu xanh di chuyển đến khoảng 1/2 gel. Sau đĩ đặt gel lên bàn UV để đọc kết quả. Kết quả điện di được ghi nhận bằng máy đọc gel. Trọng lượng phân tử để xác định ADN B. subtilis là 1500bp. Sản phẩm của quá trình PCR được gửi đi định danh ở cơng ty The First BASE Laboratories Sdn Bhd, Malaysia.
Kết quả định danh các mẫu phân lập B. subtilis được truy xuất cây Genome bằng cách sử dụng phần mềm Mega 7 và gửi giải trình tự trên ngân hàng Genome NCBI.
(https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/?search=SUB7253077).
2.4.4 Đánh giá khả năng đối kháng của B. subtilis với E.Coli
Để tiến hành so sánh và lựa chọn phương pháp đơn giản nhưng hiệu quả nhất, cĩ hai phương pháp cơ bản được nêu sau đây được tiến hành đánh giá khả năng kháng khuẩn của B. subtilis đã được phân lập từ dung dịch EPS.
a, Thử nghiệm khả năng đối kháng theo phương pháp vạch thẳng vuơng gĩc
Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng B. subtilis trên mơi trường Starch agar (SA) bao gồm: tinh bột 10g/l, peptone 5g/l, NaCl 0,5g/l, agar: 15g/l[3].
Các bước tiến hành theo phương pháp của Sertaç và cộng sự cĩ cải tiến như sau: cấy vi khuẩn B. subtilis dọc theo một đường thẳng trên đĩa thạch, ủ ở 37oC trong 24 giờ, tiến hành cấy vi khuẩn gây bệnh theo các vạch ngang vuơng gĩc với vạch vi khuẩn đã mọc, tiếp tục ủ ở 37o
C trong 24 giờ[46]. Khả năng kháng khuẩn được xác định bằng cách đo khoảng cách vùng kháng khuẩn theo đơn vị mm dựa theo Hutt và cộng sự[44]. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
b, Thử nghiệm khả năng đối kháng theo phương pháp khuếch tán
Thực hiện theo phương pháp của Moore và cộng sự cĩ điều chỉnh như sau: Vi khuẩn gây bệnh và vi khuẩn B. subtilis được hoạt hĩa trong mơi trường LB và ủ ở nhiệt độ thích hợp trong 24 giờ. Huyền phù vi khuẩn B. subtilis được điều chỉnh sao cho mật số đạt 105 CFU/ mL, 106 CFU/ mL và 107 CFU/ mL để tiến hành thử khả năng đối kháng tương ứng với nồng độ vi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
khuẩn gây bệnh là 106
CFU/ mL. Tiến hành bơm 100 µL huyền phù vi khuẩn gây bệnh lên các đĩa thạch và dùng que tran trải đều; sau đĩ, bơm 80 µL dịch vi khuẩn B. subtilis tương ứng với các nồng độ khảo sát lên bề mặt thạch đã được trải vi khuẩn gây bệnh, và đem ủ ở 37 oC trong 24 giờ. Khả năng đối kháng được đo bằng đường kính vịng ức chế vi khuẩn gây bệnh theo đơn vị mm (Hình 2.4). Tương tự vậy tiến hành làm B. subtilis phân lập từ đất và tiến hành so sánh trên cùng 1 đĩa petri. Mỗi thử nghiệm được lặp lại 3 lần.
Hình 2.2 Kháng khuẩn dựa theo phương pháp khuếch tán
Sau khi khảo sát hai phương pháp kháng khuẩn ở trên, đề tài sử dụng phương pháp đối kháng trực tiếp để xét khả năng kháng khuẩn với E. coli. Khuẩn E. coli ATCC25922 được xin giống ở bộ mơn Cơng nghệ sinh học,