A B
Hình 2.1 Kỹ thuật phân lập: A) Kỹ thuật cấy ria; B) Kỹ thuật cấy trang. trang.
Mẫu chứa hổn hợp vi khuẩn
Ria que cấy trên mơi trường nuơi cấy dạng rắn
Các dạng ria
Dịch chứa VSV
Mẫu được hút cho lên mơi trường cấy dạng rắn
Trang mẫu
Khuẩn lạc mọc lên mơi trường
Hai kỹ thuật này được sử dụng trong đề tài này nhằm phân lập và làm thuần vi khuẩn cần phân lập. Trình tự tiến hành được thực hiện như sau: hút 0,1ml dịch EPS đã chiết xuất trãi lên các đĩa petri chứa mơi trường rắn LB agar (LBA), trang đều bằng que cấy rồi đem ủ các đĩa petri này ở nhiệt độ 37oC trong vịng 24 ± 2 giờ. Chọn các khuẩn lạc đặc trưng tương tự với hình thái của B. subtilis dạng trịn lớn kích thước 3 – 5 mm, răng cưa khơng đều, màu trắng đục, bề mặt nhăn nheo. Chọn các khuẩn lạc cĩ hình thái như thế cấy chuyển sang đĩa chứa mơi trường LBA, đánh số thứ tự, ghi rõ trên từng đĩa rồi đem ủ ở 37 ºC trong 24 giờ. Tiếp tục tách rịng cho đến khi thu được dịng thuần. Các dịng vi khuẩn phân lập được nuơi tăng sinh trong mơi trường LB. Sau đĩ trữ vi khuẩn với glycerol 20-25% và giữ ở -20oC trước khi phân tích tiếp.
2.4.2 Xác định tính chất sinh hĩa của B. subtilis nghi ngờ
Các chỉ tiêu sinh hĩa để định danh các dịng vi khuẩn phân lập được chọn theo Andretta và cộng sự[4].
Xác định tính di động, sản sinh catalase, sản sinh indole, phản ứng Voges-proskauer (VP), các phản ứng lên men đường glucose, nhuộm Gram thực hiện theo Sharmin and Rahman[72].
a, Thử nghiệm khả năng di động:
Cấy đâm sâu que cấy chứa vi khuẩn trong thạch mềm, khoảng 2/3 độ dài thạch. Ủ thạch từ 18-24h ở 37oC. Nếu vi khuẩn cĩ thể di động xung quanh đường cấy, xoắn ốc hoặc làm đục tồn bộ ống thạch.
b, Thử nghiệm sản sinh catalase
Một giọt hydro peroxit 30% được đặt trên một phiến kính. Một vịng cấy vi khuẩn mới được lấy bằng que cấy vơ trùng và đặt trên giọt hydrogen peroxide. Hiện tượng xuất hiện bĩng khí cho thấy kết quả khả quang.
c, Thử nghiệm sản sinh indole
Lấy một vịng que cấy vi khuẩn mới (24 giờ tuổi) cấy vào mơi trường peptone và ủ ở 37°C trong 1-3 ngày, sau khi ủ, dung dịch Kovac được thêm vào và lắc mạnh trong một phút. Màu đỏ trên lớp thuốc thử cho thấy phản ứng dương tính.
d, Kiểm tra phản ứng Voges-proskauer (VP)
Thử nghiệm Voges Proskauer (VP) được thực hiện trên 1ml dịch cấy vi khuẩn tươi được nuơi trong mơi trường phosphate peptone. Sau khi thêm 0,2 ml KOH 40%, thêm 0,6 ml α-napthol 5% trong etanol nguyên chất. Sau 10-15 phút lắc mạnh, màu đỏ cam tươi sẽ phát triển nếu cĩ mặt acetyl metyl carbinol.
e, Nhuộm Gram
Nhỏ một giọt nước cất đã khử trùng vào giữa lam kính. Sau đĩ, chuyển 1 vịng que cấy vi khuẩn vào giọt nước đã khử trùng và trải đều thành một lớp. Mẫu được làm khơ bằng cách hơ qua ngọn lửa nhẹ hai hoặc ba lần. Nhỏ dung dịch thuốc tím ngập mẫu và để yên trong 30 giây rồi rửa kỹ bằng vịi nước chảy nhẹ. Sau đĩ, phiến kính được ngâm trong dung dịch iốt trong 1 phút và rửa kỹ bằng cồn 95% trong 10 giây. Cồn được xả sạch và rửa kỹ bằng vịi nước nhẹ. Sau đĩ, phủ safranin lên mẫu trong một phút. Sau khi rửa bằng nước máy và thấm khơ và kiểm tra dưới kính hiển vi.
f, Phản ứng lên men đường glucose
Thử nghiệm lên men trong mơi trường canh thang cĩ chứa đường, pepton và cao thịt (để cung cấp các dinh dưỡng phụ cho các vi sinh vật khĩ lên men), và chất chỉ thị mầu tía cresol brom (chất chỉ thị pH). Nếu cĩ sự lên men đường, thường sinh ra acid. Trường hợp này pH mơi trường giảm xuống đã làm cho màu tía cresol brom chuyển từ xanh sang vàng. Cũng như vậy, nếu
thêm ống Durham, sẽ cho phép xác định sự sinh hơi (H2) từ quá trình lên men. Kết quả trả lời cuối cùng là sinh acid (+/-) và gas (+/-).
2.4.3 Định danh
a, Phương pháp PCR
* Ly trích ADN: Phương pháp ly trích ADN dựa theo Boon[9]. * Chạy PCR
Các quá trình này được thực hiện ở viện Cơng nghệ Sinh học thành phố Huế.
b,Chạy điện di, đọc kết quả và sequencing (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Quá trình điện di được thực hiện với dung dịch TAE 1X và bản thạch chứa 1,5% agarose.
Chuẩn bị bản thạch: Đun nĩng dung dịch agarose bằng lị vi sĩng cho tới khi agarose tan hồn tồn, để dung dịch nguội khoảng 50o
C. Cho ethidium bromide (2µl/100 ml dung dịch gel) vào khuấy đều. Sau đĩ đổ vào khay đã chuẩn bị trước (đổ sao cho bề dày của gel cao hơn đáy của lược gel khoảng 0,3-0,5 cm).
Khi gel đặc lại cho vào bồn điện di và thêm dung dịch TAE 1X vào cho vừa bao phủ gel. Dùng pipet hút 8µl mẫu cần phân tích trộn với 2µl Loading Dye 6X cho vào từng giếng. Sử dụng thang ADN (giới hạn 100 -1517 bp) để xác định khối lượng phân tử của sản phẩm PCR. Đối chứng âm được dùng là nước cất. Khi đã cho mẫu vào các giếng, nối bồn điện di với nguồn điện (50V) để chạy điện di. Ngừng dịng điện khi màu xanh di chuyển đến khoảng 1/2 gel. Sau đĩ đặt gel lên bàn UV để đọc kết quả. Kết quả điện di được ghi nhận bằng máy đọc gel. Trọng lượng phân tử để xác định ADN B. subtilis là 1500bp. Sản phẩm của quá trình PCR được gửi đi định danh ở cơng ty The First BASE Laboratories Sdn Bhd, Malaysia.
Kết quả định danh các mẫu phân lập B. subtilis được truy xuất cây Genome bằng cách sử dụng phần mềm Mega 7 và gửi giải trình tự trên ngân hàng Genome NCBI.
(https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/?search=SUB7253077).
2.4.4 Đánh giá khả năng đối kháng của B. subtilis với E.Coli
Để tiến hành so sánh và lựa chọn phương pháp đơn giản nhưng hiệu quả nhất, cĩ hai phương pháp cơ bản được nêu sau đây được tiến hành đánh giá khả năng kháng khuẩn của B. subtilis đã được phân lập từ dung dịch EPS.
a, Thử nghiệm khả năng đối kháng theo phương pháp vạch thẳng vuơng gĩc
Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng B. subtilis trên mơi trường Starch agar (SA) bao gồm: tinh bột 10g/l, peptone 5g/l, NaCl 0,5g/l, agar: 15g/l[3].
Các bước tiến hành theo phương pháp của Sertaç và cộng sự cĩ cải tiến như sau: cấy vi khuẩn B. subtilis dọc theo một đường thẳng trên đĩa thạch, ủ ở 37oC trong 24 giờ, tiến hành cấy vi khuẩn gây bệnh theo các vạch ngang vuơng gĩc với vạch vi khuẩn đã mọc, tiếp tục ủ ở 37o
C trong 24 giờ[46]. Khả năng kháng khuẩn được xác định bằng cách đo khoảng cách vùng kháng khuẩn theo đơn vị mm dựa theo Hutt và cộng sự[44]. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
b, Thử nghiệm khả năng đối kháng theo phương pháp khuếch tán
Thực hiện theo phương pháp của Moore và cộng sự cĩ điều chỉnh như sau: Vi khuẩn gây bệnh và vi khuẩn B. subtilis được hoạt hĩa trong mơi trường LB và ủ ở nhiệt độ thích hợp trong 24 giờ. Huyền phù vi khuẩn B. subtilis được điều chỉnh sao cho mật số đạt 105 CFU/ mL, 106 CFU/ mL và 107 CFU/ mL để tiến hành thử khả năng đối kháng tương ứng với nồng độ vi
khuẩn gây bệnh là 106
CFU/ mL. Tiến hành bơm 100 µL huyền phù vi khuẩn gây bệnh lên các đĩa thạch và dùng que tran trải đều; sau đĩ, bơm 80 µL dịch vi khuẩn B. subtilis tương ứng với các nồng độ khảo sát lên bề mặt thạch đã được trải vi khuẩn gây bệnh, và đem ủ ở 37 oC trong 24 giờ. Khả năng đối kháng được đo bằng đường kính vịng ức chế vi khuẩn gây bệnh theo đơn vị mm (Hình 2.4). Tương tự vậy tiến hành làm B. subtilis phân lập từ đất và tiến hành so sánh trên cùng 1 đĩa petri. Mỗi thử nghiệm được lặp lại 3 lần.