4. Bố cục đề tài
2.4.1Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ mẫu biofloc vi tảo được nuơ
nuơi trong nước thải thủy hải sản.
a, Chiết xuất
Mẫu biofloc được lấy 1 lần/ngày vào lúc 8 giờ 30 phút sáng và mỗi lần lấy 2ml. Mẫu tảo được đựng trong hộp đựng mẫu và mang đi lọc, rửa với nước cất 1 lần trước khi trãi qua các bước chiết xuất EPS.
* Phương pháp chiết xuất EPS từ biofloc vi tảo
Phương pháp chiết xuất EPS từ biofloc đã được lọc rửa được mơ tả theo tài liệu đã được cơng bố năm 2020 của nhĩm tác giả Nguyen và cộng sự [27].
EPS cĩ ít nhất hai lớp bao bọc vi tảo trong ma trận biofloc, vì thế để kiểm sốt dấu hiệu tồn tại của EPS, sự phân tách hồn tồn của các tế bào vi tảo bị tách ra khỏi nhau bằng cách sử dụng kính hiển vi điện tử (Zeiss, Fisher Scientific UK). Lớp đầu tiên cĩ tên LB-EPS, là lớp ngồi cùng nằm trong màng sinh học được chiết xuất từ huyền phù vi tảo. Biofloc được thu thập từ quá trình nuơi cấy bằng cách lọc, sau đĩ rửa bằng nước ấm khử ion (DW) và được vortex trong 1 phút. Sau đĩ, biofloc được ủ trong một cốc cách thuỷ và lắc với 120 vịng/phút ở 30oC trong một giờ. Lúc này, các tế bào vi tảo nên được kiểm tra bằng kính hiển vi để xem xét sự phân tách một phần khỏi nhau bởi kết dính EPS. Sau đĩ, phần nổi phía trên là lớp LB-EPS được thu nhận bằng cách ly tâm hổn hợp trên ở 5000 vịng và trong 20 phút lúc 4o
C. Trong khi phần nổi phía trên được thu thập bằng phương pháp lọc sử dụng giấy Whatman 0,45 µm, sấy khơ, cân và bảo quản ở - 20oC để sử dụng cho các quá trình phân lập vi khuẩn sau này.
Trong khi đĩ cặn của quá trình li tâm được tiếp tục hồ tan lại trong 0,1M EDTA với thể tích xác định để tiếp tục chiết lớp trong cùng của màng sinh học (TB-EPS). Hỗn hợp được ủ trong cốc cách thủy và lắc như được sử dụng trong phần chiết LB-EPS trong 4 giờ. Tương tự như vậy, các tế bào vi tảo trong bước này được phân tích bằng kính hiển vi để đảm bảo rằng khơng cĩ tế bào nào bị kết dính với nhau hoặc hồn tồn tách rời nhau. Để thu thập dịch chiết TB-EPS trong phần nổi phía trên, phương pháp ly tâm được sử
dụng ở điều kiện 5000g trong 20 phút ở -4oC, lọc bằng giấy Whatman 0,45µm. Dung dịch khơng màu TB-EPS đạt được đã được sấy khơ, cân và bảo quản ở tủ lạnh sâu -20o
C.
b, Phân lập vi khuẩn B. subtilis
Phân lập vi khuẩn là phương pháp chủ yếu để tách các nhĩm vi sinh vật khác nhau. Đây là phương pháp cho phép chúng ta phân biệt các nhĩm vi khuẩn khác nhau dựa mơi trường nuơi cấy. Các vi khuẩn khác nhau phát triển khác nhau trên các mơi trường dinh dưỡng khác nhau, tùy thuộc vào nhu cầu phát triển của chúng và các yếu tố khác như nhiệt độ, pH, lượng oxy sẵn cĩ, ... Phân lập vi khuẩn là một bước quan trọng để xác định và phân loại vi khuẩn.
Kỹ thuật phân lập vi khuẩn sử dụng một số phương pháp nuơi cấy và khơng nuơi cấy. Mẫu cĩ thể được nuơi cấy và phân lập từ mơi trường rắn, lỏng và mơi trường nuơi cấy lỏng tự động. Sự phát triển của vi khuẩn trong mơi trường nuơi cấy rắn và lỏng được đặc trưng bởi sự xuất hiện của các khuẩn lạc đặc trưng và độ đục. Cĩ 2 kỹ thuật phân lập vi khuẩn cơ bản là kỹ thuật cấy ria và cấy trang.
A B
Hình 2.1 Kỹ thuật phân lập: A) Kỹ thuật cấy ria; B) Kỹ thuật cấy trang.
Mẫu chứa hổn hợp vi khuẩn
Ria que cấy trên mơi trường nuơi cấy dạng rắn
Các dạng ria
Dịch chứa VSV
Mẫu được hút cho lên mơi trường cấy dạng rắn
Trang mẫu
Khuẩn lạc mọc lên mơi trường
Hai kỹ thuật này được sử dụng trong đề tài này nhằm phân lập và làm thuần vi khuẩn cần phân lập. Trình tự tiến hành được thực hiện như sau: hút 0,1ml dịch EPS đã chiết xuất trãi lên các đĩa petri chứa mơi trường rắn LB agar (LBA), trang đều bằng que cấy rồi đem ủ các đĩa petri này ở nhiệt độ 37oC trong vịng 24 ± 2 giờ. Chọn các khuẩn lạc đặc trưng tương tự với hình thái của B. subtilis dạng trịn lớn kích thước 3 – 5 mm, răng cưa khơng đều, màu trắng đục, bề mặt nhăn nheo. Chọn các khuẩn lạc cĩ hình thái như thế cấy chuyển sang đĩa chứa mơi trường LBA, đánh số thứ tự, ghi rõ trên từng đĩa rồi đem ủ ở 37 ºC trong 24 giờ. Tiếp tục tách rịng cho đến khi thu được dịng thuần. Các dịng vi khuẩn phân lập được nuơi tăng sinh trong mơi trường LB. Sau đĩ trữ vi khuẩn với glycerol 20-25% và giữ ở -20oC trước khi phân tích tiếp.