nhẹ. Để đĩa phản ứng ở nhiệt độ phòng, đọc kết quả sau 25-30 phút;
- Đọc kết quả.
+ Phản ứng dương tính: Có hạt ngưng kết lấm chấm;
+ Phản ứng âm tính: Hồng cầu lắng xuống đáy tạo thành chấm tròn;
+ Hiệu giá ngưng kết được tính ở độ pha loãng kháng nguyên cao nhất còn xuất hiện ngưng kết hoàn toàn. Hiệu giá ngưng kết này được tính là 1 đơn vị HA= 1HAU.
- Sơ đồ thực hiện được thể hiện ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Sơ đồ thực hiện phản ứng HACác Giếng Các Giếng bước N.liệu PBS/NaCl Pha 0.9% ( loãng Kháng KN nguyên ( Hồng cầu Cho ( hồng Độ pha cầu loãng KN
30
3.5.2. Phương pháp xác định hiệu giá virus ND (LaSota) trên trứng gà có phôi (EID50) phôi (EID50)
Giống sản xuất, dịch virus được chuẩn độ trên trứng gà có phôi 9-11 ngày tuổi và được tính toán theo phương pháp Reed – Muench. (Reed & Muench, 1938)
-Dùng dung dịch PBS (hoặc nước muối sinh lý 0,9%) pha loãng virus theo cơ số 10 để có dãy nồng độ từ 10-1 đến 10-10.
-Gây nhiễm virus ở các nồng độ pha loãng vào xoang niệu nang của trứng gà có phôi 9-11 ngày tuổi, mỗi nồng độ 5 quả, mỗi quả 0,1ml. 5 quả không tiêm làm đối chứng.
- Trứng sau gây nhiễm được theo dõi hàng ngày trong 5 ngày.
- Những trứng chết phôi trước 24 giờ được thải bỏ.
- Những trứng chết từ sau 24 giờ đến 5 ngày được cất tủ lạnh 2 -80C.
-Sau 5 ngày toàn bộ trứng sống được giết phôi ở 2-80C qua đêm hoặc ít nhất 4 tiếng trước khi đọc kết quả.
-Trứng sau khi được giết lạnh, tiến hành mổ trứng, thu dịch niệu nang. Đánh giá sự có mặt virus Newcastle bằng phản ứng HA
- Ghi kết quả ở các nồng độ pha loãng
- Tính toán liều gây nhiễm 50% (EID50) theo phương pháp Reed- Muench.
Tỷ lệ phôi nhiễm (%) = Tổng nhiễm/ (Tổng số nhiễm + Tổng số không nhiễm) x 100
A-50
EID50 = x (b – a) + a A – B
A: là tỉ lệ % phôi nhiễm cận trên 50%.
B: là tỉ lệ % phôi nhiễm cận dưới 50%.
a: liều gây nhiễm phôi cận trên 50% tính theo độ pha loãng virus.
b: liều gây nhiễm phôi cận dưới 50% tính theo độ pha loãng virus.
3.5.3. Phương pháp xác định chỉ số độc lực virus Newcastle trên não gà con01 ngày tuổi (ICPI - Intracerebral Pathogenicity Index) 01 ngày tuổi (ICPI - Intracerebral Pathogenicity Index)
-Chuẩn bị dịch niệu nang virus LaSota có hiệu giá HA trên 4log2. Pha loãng virus 1/10 trong PBS vô trùng.
-Gà được theo dõi trong 8 ngày liền, ghi lại những biểu hiện sức khoẻ: ốm, chết, bình thường. Biểu hiện bệnh được tính bằng điểm: Chết (2 điểm); ốm (1 điểm), bình thường (0 điểm).