4.2.1. Kết quả sản xuất kháng nguyên ND (LaSota) và IB-H120
Virus Newcastle và virus IB-H120 là những virus thích nghi trên phôi trứng gà 9-11 ngày tuổi. Việc sản xuất kháng nguyên trên phôi trứng thu được một lượng lớn kháng nguyên, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí sản xuất. Kết quả sản xuất kháng nguyên được trình bày ở bảng 4.9.
Bảng 4.9. Kết quả sản xuất kháng nguyên LaSota và IB-H120 Tên Tên Kháng giống nguyên virus ND- LaSota LaSota IB- IB-H120 H120
Qua bảng 4.9 cho thấy, sau thời gian gây nhiễm 96 giờ, ở nồng độ gây nhiễm 10-3, hiệu giá virus của kháng nguyên LaSota thu được có hiệu giá HA đạt
10 log2 và 109,7EID50/1ml. Sau thời gian gây nhiễm 120 giờ, ở nồng độ gây nhiễm 10-2, hiệu giá virus của kháng nguyên IB-H120 thu được có hiệu giá 106,9EID50/1ml.
4.2.2. Kết quả lựa chọn chất bất hoạt virus
Để lựa chọn được chất bất hoạt phù hợp, chúng tôi tiến hành bất hoạt bằng 3 chất bất hoạt khác nhau: Formalin, BEI và β- probiolacton theo nồng độ và thời gian quy định. Các kháng nguyên virus/vi khuẩn sau bất hoạt được kiểm tra tính bất hoạt bằng cách nhân liên tiếp 2 lần trên môi trường nuôi cấy thích hợp. Nếu cả 2 lần liên tiếp đều không thấy sự nhân lên của virus, chứng tỏ kháng nguyên được bất hoạt hoàn toàn.
Với kháng nguyên LaSota và IB –H120 sau bất hoạt, được gây nhiễm liên tiếp 2 lần trên trứng gà có phôi 9 - 11 ngày tuổi. Kết quả kiểm tra hai loại virus sau bất hoạt được trình bày qua bảng 4.10.
Bảng 4.10. Kết quả kiểm tra virus sau bất hoạt trên phôi trứng
Chất bất hoạt
Formalin BEI
β- probiolacton
Kết quả kiểm tra tính bất hoạt cho thấy, Formalin ở nồng độ 0,2%, BEI 0,1M và β-propiolacton 0,1% có khả năng bất hoạt hoàn toàn virus và ở các nồng độ này, các chất bất hoạt cũng không gây ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi gà.
Các kháng nguyên sau bất hoạt được kiểm tra đáp ứng miễn dịch trên gà 3 tuần tuổi, mỗi loại chất bất hoạt được coi là 1 lô thí nghiệm, 10 gà/lô thí nghiệm. Gà có hiệu giá kháng thể âm tính với hai loại virus sẽ được tiến hành thí nghiệm. Gà được theo dõi, chăm sóc giống nhau trong suốt quá trình thí nghiệm. Kết quả kiểm tra được trình bày tại bảng 4.11.
Bảng 4.11. Kết quả kiểm tra tính đáp ứng miễn dịch của virus sau vô hoạt trên gà thí nghiệm tại D21
Tên VR
ND
(LaSota)
IB-H120
Theo số liệu ở bảng 4.11 cho thấy, kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle của 3 lô gà thí nghiệm được gây miễn dịch bởi virus ND (LaSota) bất hoạt bằng 3 chất bất hoạt đều cho hiệu giá kháng thể >4 log2. Tuy
cho hiệu giá kháng thể trung bình thấp hơn (chỉ đạt 7,2). Trong 3 lô gà thí nghiệm được gây miễn dịch bởi virus IB bất hoạt, chỉ có virus IB được bất hoạt
bằng formalin 0,2% cho đáp ứng miễn dịch tốt nhất, 100% gà có đáp ứng miễn dịch đối với virus IB.
Trên cơ sở kết quả kiểm tra virus sau bất hoạt trên phôi gà và đáp ứng miễn dịch trên gà thí nghiệm cho thấy Formalin là chất bất hoạt phù hợp với cả 02 loại kháng nguyên LaSota và IB-H120.
4.2.3. Kết quả xác định hàm lượng mỗi kháng nguyên có trong 1 liều vắc xinđơn đơn
Để xác định hàm lượng kháng nguyên theo cơ số 10 có trong 01 liều vắc xin đơn, trong khuôn khổ đề tài tiến hành nghiên cứu 5 thang liều với từng loại kháng nguyên như sau:
Đối với kháng nguyên LaSota, từ 106 đến 1010 EID50/liều virus trước bất hoạt; Đối với kháng nguyên IBV, từ 103 đến 108 EID50/liều virus trước bất hoạt. Để có được kháng nguyên có hiệu giá cao hơn hiệu giá kháng nguyên kiểm tra được sẽ thực hiện biện pháp cô đặc kháng nguyên bằng máy siêu ly tâm.
Trên cơ sở lựa chọn được Formalin 0,2% sử dụng làm chất bất hoạt virus. Kết quả kiểm tra virus ND chủng LaSota bất hoạt được trình bày ở bảng 4.12.
Bảng 4.12. Kết quả kiểm tra virus ND (LaSota) ở 5 thang liều sau bất hoạt trên phôi trứng Lô TN Hiệu giá KN (EID50/liều) TN1 TN2 TN3 TN4 TN5
Kết quả bảng 4.12 cho thấy virus ND chủng LaSota tại các thang liều được sau 2 lần kiểm tra trên phôi trứng cho kết quả âm tính chứng tỏ bất hoạt hoàn toàn và không gây ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi gà.
Với virus IB tại 5 thang liều cũng được tiến hành kiểm tra virus sau bất hoạt trên trứng gà có phôi. Kết quả thực hiện cho thấy virus được bất hoat hoàn toàn trên trứng gà có phôi. Kết quả được trình bày ở bảng 4.13.
Bảng 4.13. Kết quả kiểm tra virus IB-H120 ở 5 thang liều sau bất hoạt trên phôi trứng
Lô TN TN1 TN2 TN3 TN4 TN5
Với mỗi loại vắc xin đơn tại từng thang liều, sau khi phối trộn với dầu Montanide ISA 71RVG theo tỷ lệ 60:40. Ở mỗi công thức đều được kiểm tra các chỉ tiêu về nhũ, độ nhớt, vô trùng. Kết quả được trình bày ở bảng 4.14.
Bảng 4.14. Kết quả kiểm tra vắc xin đơn ở từng hiệu giá kháng nguyên sau phối trộn với nhũ dầu
Loại VX
VX LaSota
VX IB- H120
Kết quả tại bảng 4.14 cho thấy độ nhớt trung bình của vắc xin nhũ dầu dao động từ 40-42 mPa.s. Tất cả các mẫu vắc xin đơn kiểm tra đều đạt độ ổn định và chỉ tiêu vô trùng.
Để đánh giá chất lượng vắc xin đơn toàn diện, vắc xin phải an toàn và sinh miễn dịch trên động vật thí nghiệm. Mỗi lô thí nghiệm để kiểm tra độ an toàn cho mỗi loại vắc xin đơn được thực hiện trên 10 gà thí nghiệm với liều gấp đôi liều
Kết quả cho thấy toàn bộ gà thí nghiệm trong thời gian theo dõi đều sống khỏe mạnh bình thường, không có gà nào có biểu hiện của bệnh Newcastle và bệnh viêm phế quản truyền nhiễm. Vắc xin đều đạt chỉ tiêu an toàn trên động vật mẫn cảm.
Bảng 4.15. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn từng vắc xin đơn tại 5 thang liều sau phối trộn với chất bổ trợ dầu
Hiệu Loại VX KN (EID VX LaSota nhũ dầu VX IB nhũ dầu Lô đối chứng
Vắc xin được đánh giá đáp ứng miễn dịch trên gà 3 tuần tuổi, mỗi công thức tương ứng với 1 lô thí nghiệm, mỗi lô thí nghiệm sử dụng 10 gà, theo dõi thu thập mẫu huyết thanh để kiểm tra hiệu giá kháng thể tại các thời điểm D7, D14, D21, D28.
Đánh giá đặc tính sinh miễn dịch của vắc xin Newcastle bằng việc đánh giá hiệu giá kháng thể kháng virus ND thông qua phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà (HI). Kết quả được trình bày qua bảng 4.16.
Bảng 4.16. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng virus ND (LaSota) bằng phương pháp HI Lô TN Hiệu giá KN (EID50/liều) TN1 TN2 TN3
Qua bảng 4.16 cho thấy hiệu giá kháng thể bắt đầu xuất hiện ở ngày thứ 7 sau khi tiêm vắc xin, tuy nhiên hiệu giá kháng thể trung bình rất thấp, dao động từ 1,5-2,5 log2. Tại ngày thứ 14 sau khi tiêm vắc xin, hiệu giá kháng thể tăng dần ổn định tại ngày thứ 21 sau tiêm vắc xin. Hiệu giá kháng thể kháng virus ND trong 5 lô thí nghiệm tại cùng một thời điểm lấy mẫu xét nghiệm cho thấy ở hiệu giá kháng nguyên 106EID50/liều cho hiệu giá kháng thể trung bình thấp nhất. Hiệu giá kháng thể đạt mức cao và ổn định tại liều 108EID50/liều.
Đối với vắc xin IB, việc đánh giá đặc tính sinh miễn dịch bằng việc đánh giá hiệu giá kháng thể kháng virus ND thông qua phản ứng ELISA. Theo hướng dẫn sử dụng Kit ELISA của hàng IDEXX, mẫu huyết thanh có kết quả s/p > 0,2 được đánh giá dương tính. Kết quả trình bày tại bảng 4.17.
Bảng 4.17. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể IBV bằng phương pháp Elisa Lô TN TN1 TN2 TN3 TN4 TN5
Kết quả bảng 4.17 cho thấy ở ngày thứ 7 sau khi tiêm vắc xin, 4/5 lô thí nghiệm chưa xuất hiện kháng thể kháng virus IB. Ở nồng độ kháng nguyên 107EID50/liều, từ ngày thứ 7 đã có gà thí nghiệm sinh đáp ứng miễn dịch chống virus IB, tuy nhiên tỷ lệ rất thấp. Tại thời điểm 14 ngày sau khi tiêm vắc xin, gà ở tất cả các lô thí nghiệm đã có kháng thể kháng virus IB, theo tỷ lệ tăng dần từ nồng độ 103EID50/liều đến nồng độ 107EID50/liều. Hiệu giá kháng thể tăng và ổn định tại ngày thứ 21 sau tiêm vắc xin. Hiệu giá kháng thể đạt mức cao và ổn định tại nồng độ kháng nguyên 106EID50/liều và 107EID50/liều.
Để có thêm căn cứ kết luận hàm lượng kháng nguyên có trong một liều vắc xin đơn, tiến hành kiểm chứng lại để làm căn cứ xây dựng liều cơ sở cho phối trộn vắc xin nhị giá.
Vắc xin đơn sau khi phối trộn được kiểm tra đầy đủ các chỉ tiêu hóa lý, vô trùng. Đối với chỉ tiêu hóa lý vắc xin vô hoạt, tiến hành kiểm tra đánh giá cảm
quan vắc xin phải có màu trắng ngà, đồng nhất, không phân lớp. Các chỉ tiêu độ nhớt, độ ổn định được thực hiện theo phương pháp thường quy. Kết quả trình bày tại bảng 4.18.
Bảng 4.18. Kết quả kiểm tra vắc xin đơn sau phối trộn với chất bổ trợ dầu
Loại VX
VX LaSota
VX IB-H120
Kết quả tại bảng 4.18 cho thấy độ nhớt trung bình của vắc xin nhũ dầu dao động từ 40-42 mPa.s. Tất cả các mẫu vắc xin đơn kiểm tra đều đạt độ ổn định và chỉ tiêu vô trùng.
Để đánh giá chất lượng vắc xin đơn toàn diện, vắc xin phải an toàn và sinh miễn dịch trên động vật thí nghiệm. Mỗi lô thí nghiệm để kiểm tra độ an toàn cho mỗi loại vắc xin đơn được thực hiện trên 10 gà thí nghiệm với liều gấp đôi liều khuyến cáo. Thời gian theo dõi thí nghiệm 21 ngày. Kết quả kiểm tra độ an toàn của từng vắc xin đơn được trình bày ở bảng 4.19.
Kết quả cho thấy toàn bộ gà thí nghiệm trong thời gian theo dõi đều sống khỏe mạnh bình thường, không có gà nào có biểu hiện của bệnh Newcastle và bệnh viêm phế quản truyền nhiễm. Vắc xin đều đạt chỉ tiêu an toàn trên động vật mẫn cảm.
Bảng 4.19. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn từng vắc xin đơn sau phối trộn với chất bổ trợ dầu
Loại VX VX LaSota nhũ dầu VX IB nhũ dầu Lô đối chứng
Với vắc xin LaSota, đánh giá hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà. Kết quả trình bày ở bảng 4.20.
Bảng 4.20. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể LaSota bằng phương pháp HI HGKN:
108/liều
GMT
Kết quả cho thấy, tại liều 108EID50/liều, kháng thể xuất hiện ổn định và tỷ lệ dương tính là 100% tại thời điểm 14 ngày sau tiêm.
Để đánh giá hiệu lực bảo hộ vắc xin LaSota, 14 ngày sau khi tiêm vắc xin, gà miễn dịch cùng gà đối chứng được thử thách với virus Newcastle cường độc chủng VN91 theo đường tiêm dưới da, mỗi con 1 liều tương đương 105 EID50. Theo dõi 10 ngày, lô vắc xin đạt tiêu chuẩn nếu ≥ 80% gà miễn dịch đều sống khỏe, không có biểu hiện của bệnh Newcastle. Lô đối chứng ít nhất 80% gà chết vì bệnh Newcastle. Kết quả trình bày tại bảng 4.21.
Kết quả công cường độc cho thấy hiệu lực phòng bệnh do vắc xin LaSota tạo ra đạt tỷ lệ 90% xác định bằng phương pháp thử thách cường độc, đáp ứng tiêu chuẩn theo quy định hiện hành.
Bảng 4.21. Kết quả đánh giá hiệu lực bảo hộ vắc xin LaSota vô hoạt
STT Chỉ tiêu 1 Số gà TN (con) 2 Tuổi gà (ngày) 3 Liều dùng (liều) 4 Số gà công (con) 5 Liều công 6 Số gà chết (con) 7 Số gà khỏe (con) 8 Tỷ lệ bảo hộ (%)
Với vắc xin IB, đánh giá hiệu lực bảo hộ căn cứ hiệu giá kháng thể kháng virus IB bằng phản ứng ELISA. Kết quả trình bày ở bảng 4.22.
Bảng 4.22. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng virus IB HGKN 106EID50
Tỷ lệ dương tính (%)
Kết quả cho thấy, tại nồng độ kháng nguyên105EID50 virus IB/liều, kháng thể xuất hiện ổn định sau 21 ngày sử dụng vắc xin và tỷ lệ mẫu huyết thanh dương tính đạt 95%. Hiệu lực bảo hộ vắc xin IB đạt 95%.
4.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN VÔ HOẠT ND-IB XIN VÔ HOẠT ND-IB
4.3.1. Kết quả phối trộn 9 nghiệm thức vắc xin vô hoạt
Sau khi xác định được hiệu giá virus tối ưu cơ số 10 ngưỡng trên và ngưỡng dưới, việc xác định hàm lượng kháng nguyên có trong 1 liều vắc xin đơn theo cơ số 2 với 3 thang liều tương ứng từng loại kháng nguyên được thực hiện. Với kháng nguyên LaSota, sử dụng 3 thang liều 4x107 - 8x107 - 16x107 EID50/liều; Với kháng nguyên IBV sử dụng 3 thang liều 4x105 - 8x105 - 16x105 EID50/liều
Vắc xin sau khi phối trộn được kiểm tra các chỉ tiêu độ nhớt, kích thước, độ ổn định và chỉ tiêu vô trùng để đánh giá chất lượng nhũ dầu. Kết quả trình bày ở bảng 4.23.
Bảng 4.23. Kết quả kiểm tra 9 nghiệm thức sau phối trộn 2 loại kháng nguyên với chất bổ trợ dầu
Chỉ tiêu kiểm tra
Cảm quan
Độ nhớt
Kết quả bảng 4.23 cho thấy 9 nghiệm thức vắc xin nhị giá phối trộn với chất bổ trợ dầu đều có màu trắng sữa, đồng nhất, không phân lớp, không đông vón, không lắng cặn, không có dị vật, không bị phân lớp, đều đạt chỉ tiêu vô trùng.
Độ nhớt vắc xin đạt giá trị trung bình 40,3 mPa.s, nằm trong giới hạn cho phép đối với vắc xin nhũ dầu 30-45 mPa.s.
4.3.2. Kết quả đánh giá 9 nghiệm thức vắc xin trên động vật thí nghiệm
Tại mỗi nghiệm thức, thử nghiệm trên gà mẫn cảm. Sau thời gian theo dõi, đánh giá độ an toàn và hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle bằng phản ứng HI, kháng thể kháng virus IB bằng phản ứng ELISA. Kết quả được trình bày bảng 4.24.
Bảng 4.24. Kết quả đánh giá 9 nghiệm thức trên động vật thí nghiệm
ND-HI (HI trung bình) (% Titer ≥ 4 log2)
Số nghiệm thức
IB-Elisa (% dương tính)
Số nghiệm thức
Theo số liệu bảng 4.24 cho thấy, với mỗi một loại kháng thể, tỷ lệ nghiệm thức cho kết quả phân đều ở 3 nhóm, nhóm cho kết quả <50%; nhóm cho kết quả từ 50% -79%, và nhóm cho kết quả ≥80% dương tính với các phương pháp xét nghiệm huyết thanh học. Có 2 nghiệm thức chung cho kết quả ≥80% mẫu huyết thanh dương tính với kháng thể kháng virus ND và kháng thể kháng virus IB.
Theo dữ liệu, lựa chọn được nghiệm thức tối ưu nhất thỏa mãn cho hiệu giá huyết thanh cao với cả 2 bệnh Newcastle và bệnh Viêm khí quản truyền nhiễm bao gồm nồng độ kháng nguyên virus Newcastle chủng LaSota là 16.107 EID50/liều và 8.105 EID50/liều đối với virus IB-H120
4.3.3. Kết quả nghiên cứu Quy trình sản xuất vắc xin vô hoạt ND-IB với chấtbổ trợ dầu bổ trợ dầu
Để có vắc xin chất lượng, yêu cầu nguyên liệu sử dụng trong sản xuất phải được lựa chọn đáp ứng đúng tiêu chuẩn, thao tác kỹ thuật dứt khoát, tránh tạp nhiễm trong quá trình thực hiện.
Quy trình sản xuất vắc xin vô hoạt ND-IB với chất bổ trợ dầu được biểu diễn ở hình 4.1. Giai đoạn 1 Giai đoạn 2
Chuẩn bị kháng nguyên virus Newcastle:
(1)Vệ sinh trứng và ấp trứng 37,50C, độ ẩm 65%
(2)Gây nhiễm virus Newcastle vào trứng gà có phôi
(3)Ấp tiếp ở 370C, độ ẩm 65% (4)Thu hoạch dịch niệu nang