Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.2. Kết quả xác định liều cơ bản vắc xin đơn giá
4.2.3. Kết quả xác định hàm lượng mỗi kháng nguyên có tron g1 liều vắc xin
đơn
Để xác định hàm lượng kháng nguyên theo cơ số 10 có trong 01 liều vắc xin đơn, trong khuôn khổ đề tài tiến hành nghiên cứu 5 thang liều với từng loại kháng nguyên như sau:
Đối với kháng nguyên LaSota, từ 106 đến 1010 EID50/liều virus trước bất hoạt; Đối với kháng nguyên IBV, từ 103 đến 108 EID50/liều virus trước bất hoạt. Để có được kháng nguyên có hiệu giá cao hơn hiệu giá kháng nguyên kiểm tra được sẽ thực hiện biện pháp cô đặc kháng nguyên bằng máy siêu ly tâm.
Trên cơ sở lựa chọn được Formalin 0,2% sử dụng làm chất bất hoạt virus. Kết quả kiểm tra virus ND chủng LaSota bất hoạt được trình bày ở bảng 4.12.
Bảng 4.12. Kết quả kiểm tra virus ND (LaSota) ở 5 thang liều sau bất hoạt trên phôi trứng Lô TN Hiệu giá KN (EID50/liều) TN1 TN2 TN3 TN4 TN5
Kết quả bảng 4.12 cho thấy virus ND chủng LaSota tại các thang liều được sau 2 lần kiểm tra trên phôi trứng cho kết quả âm tính chứng tỏ bất hoạt hoàn toàn và không gây ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi gà.
Với virus IB tại 5 thang liều cũng được tiến hành kiểm tra virus sau bất hoạt trên trứng gà có phôi. Kết quả thực hiện cho thấy virus được bất hoat hoàn toàn trên trứng gà có phôi. Kết quả được trình bày ở bảng 4.13.
Bảng 4.13. Kết quả kiểm tra virus IB-H120 ở 5 thang liều sau bất hoạt trên phôi trứng
Lô TN TN1 TN2 TN3 TN4 TN5
Với mỗi loại vắc xin đơn tại từng thang liều, sau khi phối trộn với dầu Montanide ISA 71RVG theo tỷ lệ 60:40. Ở mỗi công thức đều được kiểm tra các chỉ tiêu về nhũ, độ nhớt, vô trùng. Kết quả được trình bày ở bảng 4.14.
Bảng 4.14. Kết quả kiểm tra vắc xin đơn ở từng hiệu giá kháng nguyên sau phối trộn với nhũ dầu
Loại VX
VX LaSota
VX IB- H120
Kết quả tại bảng 4.14 cho thấy độ nhớt trung bình của vắc xin nhũ dầu dao động từ 40-42 mPa.s. Tất cả các mẫu vắc xin đơn kiểm tra đều đạt độ ổn định và chỉ tiêu vô trùng.
Để đánh giá chất lượng vắc xin đơn toàn diện, vắc xin phải an toàn và sinh miễn dịch trên động vật thí nghiệm. Mỗi lô thí nghiệm để kiểm tra độ an toàn cho mỗi loại vắc xin đơn được thực hiện trên 10 gà thí nghiệm với liều gấp đôi liều
Kết quả cho thấy toàn bộ gà thí nghiệm trong thời gian theo dõi đều sống khỏe mạnh bình thường, không có gà nào có biểu hiện của bệnh Newcastle và bệnh viêm phế quản truyền nhiễm. Vắc xin đều đạt chỉ tiêu an toàn trên động vật mẫn cảm.
Bảng 4.15. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn từng vắc xin đơn tại 5 thang liều sau phối trộn với chất bổ trợ dầu
Hiệu Loại VX KN (EID VX LaSota nhũ dầu VX IB nhũ dầu Lô đối chứng
Vắc xin được đánh giá đáp ứng miễn dịch trên gà 3 tuần tuổi, mỗi công thức tương ứng với 1 lô thí nghiệm, mỗi lô thí nghiệm sử dụng 10 gà, theo dõi thu thập mẫu huyết thanh để kiểm tra hiệu giá kháng thể tại các thời điểm D7, D14, D21, D28.
Đánh giá đặc tính sinh miễn dịch của vắc xin Newcastle bằng việc đánh giá hiệu giá kháng thể kháng virus ND thông qua phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà (HI). Kết quả được trình bày qua bảng 4.16.
Bảng 4.16. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng virus ND (LaSota) bằng phương pháp HI Lô TN Hiệu giá KN (EID50/liều) TN1 TN2 TN3
Qua bảng 4.16 cho thấy hiệu giá kháng thể bắt đầu xuất hiện ở ngày thứ 7 sau khi tiêm vắc xin, tuy nhiên hiệu giá kháng thể trung bình rất thấp, dao động từ 1,5-2,5 log2. Tại ngày thứ 14 sau khi tiêm vắc xin, hiệu giá kháng thể tăng dần ổn định tại ngày thứ 21 sau tiêm vắc xin. Hiệu giá kháng thể kháng virus ND trong 5 lô thí nghiệm tại cùng một thời điểm lấy mẫu xét nghiệm cho thấy ở hiệu giá kháng nguyên 106EID50/liều cho hiệu giá kháng thể trung bình thấp nhất. Hiệu giá kháng thể đạt mức cao và ổn định tại liều 108EID50/liều.
Đối với vắc xin IB, việc đánh giá đặc tính sinh miễn dịch bằng việc đánh giá hiệu giá kháng thể kháng virus ND thông qua phản ứng ELISA. Theo hướng dẫn sử dụng Kit ELISA của hàng IDEXX, mẫu huyết thanh có kết quả s/p > 0,2 được đánh giá dương tính. Kết quả trình bày tại bảng 4.17.
Bảng 4.17. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể IBV bằng phương pháp Elisa Lô TN TN1 TN2 TN3 TN4 TN5
Kết quả bảng 4.17 cho thấy ở ngày thứ 7 sau khi tiêm vắc xin, 4/5 lô thí nghiệm chưa xuất hiện kháng thể kháng virus IB. Ở nồng độ kháng nguyên 107EID50/liều, từ ngày thứ 7 đã có gà thí nghiệm sinh đáp ứng miễn dịch chống virus IB, tuy nhiên tỷ lệ rất thấp. Tại thời điểm 14 ngày sau khi tiêm vắc xin, gà ở tất cả các lô thí nghiệm đã có kháng thể kháng virus IB, theo tỷ lệ tăng dần từ nồng độ 103EID50/liều đến nồng độ 107EID50/liều. Hiệu giá kháng thể tăng và ổn định tại ngày thứ 21 sau tiêm vắc xin. Hiệu giá kháng thể đạt mức cao và ổn định tại nồng độ kháng nguyên 106EID50/liều và 107EID50/liều.
Để có thêm căn cứ kết luận hàm lượng kháng nguyên có trong một liều vắc xin đơn, tiến hành kiểm chứng lại để làm căn cứ xây dựng liều cơ sở cho phối trộn vắc xin nhị giá.
Vắc xin đơn sau khi phối trộn được kiểm tra đầy đủ các chỉ tiêu hóa lý, vô trùng. Đối với chỉ tiêu hóa lý vắc xin vô hoạt, tiến hành kiểm tra đánh giá cảm
quan vắc xin phải có màu trắng ngà, đồng nhất, không phân lớp. Các chỉ tiêu độ nhớt, độ ổn định được thực hiện theo phương pháp thường quy. Kết quả trình bày tại bảng 4.18.
Bảng 4.18. Kết quả kiểm tra vắc xin đơn sau phối trộn với chất bổ trợ dầu
Loại VX
VX LaSota
VX IB-H120
Kết quả tại bảng 4.18 cho thấy độ nhớt trung bình của vắc xin nhũ dầu dao động từ 40-42 mPa.s. Tất cả các mẫu vắc xin đơn kiểm tra đều đạt độ ổn định và chỉ tiêu vô trùng.
Để đánh giá chất lượng vắc xin đơn toàn diện, vắc xin phải an toàn và sinh miễn dịch trên động vật thí nghiệm. Mỗi lô thí nghiệm để kiểm tra độ an toàn cho mỗi loại vắc xin đơn được thực hiện trên 10 gà thí nghiệm với liều gấp đôi liều khuyến cáo. Thời gian theo dõi thí nghiệm 21 ngày. Kết quả kiểm tra độ an toàn của từng vắc xin đơn được trình bày ở bảng 4.19.
Kết quả cho thấy toàn bộ gà thí nghiệm trong thời gian theo dõi đều sống khỏe mạnh bình thường, không có gà nào có biểu hiện của bệnh Newcastle và bệnh viêm phế quản truyền nhiễm. Vắc xin đều đạt chỉ tiêu an toàn trên động vật mẫn cảm.
Bảng 4.19. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn từng vắc xin đơn sau phối trộn với chất bổ trợ dầu
Loại VX VX LaSota nhũ dầu VX IB nhũ dầu Lô đối chứng
Với vắc xin LaSota, đánh giá hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà. Kết quả trình bày ở bảng 4.20.
Bảng 4.20. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể LaSota bằng phương pháp HI HGKN:
108/liều
GMT
Kết quả cho thấy, tại liều 108EID50/liều, kháng thể xuất hiện ổn định và tỷ lệ dương tính là 100% tại thời điểm 14 ngày sau tiêm.
Để đánh giá hiệu lực bảo hộ vắc xin LaSota, 14 ngày sau khi tiêm vắc xin, gà miễn dịch cùng gà đối chứng được thử thách với virus Newcastle cường độc chủng VN91 theo đường tiêm dưới da, mỗi con 1 liều tương đương 105 EID50. Theo dõi 10 ngày, lô vắc xin đạt tiêu chuẩn nếu ≥ 80% gà miễn dịch đều sống khỏe, không có biểu hiện của bệnh Newcastle. Lô đối chứng ít nhất 80% gà chết vì bệnh Newcastle. Kết quả trình bày tại bảng 4.21.
Kết quả công cường độc cho thấy hiệu lực phòng bệnh do vắc xin LaSota tạo ra đạt tỷ lệ 90% xác định bằng phương pháp thử thách cường độc, đáp ứng tiêu chuẩn theo quy định hiện hành.
Bảng 4.21. Kết quả đánh giá hiệu lực bảo hộ vắc xin LaSota vô hoạt
STT Chỉ tiêu 1 Số gà TN (con) 2 Tuổi gà (ngày) 3 Liều dùng (liều) 4 Số gà công (con) 5 Liều công 6 Số gà chết (con) 7 Số gà khỏe (con) 8 Tỷ lệ bảo hộ (%)
Với vắc xin IB, đánh giá hiệu lực bảo hộ căn cứ hiệu giá kháng thể kháng virus IB bằng phản ứng ELISA. Kết quả trình bày ở bảng 4.22.
Bảng 4.22. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng virus IB HGKN 106EID50
Tỷ lệ dương tính (%)
Kết quả cho thấy, tại nồng độ kháng nguyên105EID50 virus IB/liều, kháng thể xuất hiện ổn định sau 21 ngày sử dụng vắc xin và tỷ lệ mẫu huyết thanh dương tính đạt 95%. Hiệu lực bảo hộ vắc xin IB đạt 95%.