Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Tính nhạy của vi khuẩn Aeromonas veronii với kháng sinh Florphenicol và Nano bạc và Nano bạc
Mục đích: Xác định được khả năng kháng khuẩn của kháng sinh và Nano bạc đối với vi khuẩn A. veronii.
Nguyên lý: Phương pháp kháng sinh đồ dựa trên sự khuếch tán của kháng sinh trên thạch đĩa của Kirby-Bauer (Bauer & cs., 1966), dựa trên đường kính vòng vô khuẩn theo tiêu chuẩn của Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (2007). Các bước tiến hành:
1, Thí nghiệm gồm 5 công thức (CT), mỗi CT được bố trí lặp lại ba lần, liều lượng sử dụng như sau: Công thức thí nghiệm CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 (Đối chứng)
2, Vi khuẩn gốc được phân lập từ cá nhiễm bệnh do Aeromonas veronii và lưu trữ tại bộ môn Môi trường và bệnh thuỷ sản – Khoa Thuỷ sản Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Sau đó được nuôi tăng sinh trong môi trường Nutrient Broth (NB) trong 20-24 giờ ở nhiệt độ 28 – 300C.
3, Đĩa thạch TSA được chuẩn bị trước cấy 100 µl vi khuẩn A.veronii trên có mật độ 0.26 x 109 cfu/mL, trang đều cho khô.
4, Đặt lên mỗi đĩa 2 khoanh giấy có độ dày 0,5 mm, đường kính 4mm đã được vô trùng sao cho mặt khoanh giấy áp sát vào mặt môi trường.
5, Nhỏ lượng kháng sinh và Nano bạc 10 µl/một đĩa giấy đối với từng công thức thí nghiệm.
6, Để đĩa thạch trong tủ ấm 300C. Vòng vô khuẩn được quan sát và đo sau 24h. 3.4.2. Điều trị bệnh do vi khuẩn Aeromonas veronii trong phòng thí nghiệm Thời gian thí nghiệm: từ 09/07 – 31/07/2020
Mục đích: Kiểm chứng xem khi kết hợp kháng sinh với Nano bạc có thể điều trị được bệnh do vi khuẩn A. veronii gây ra trên cá Nheo mỹ.
Nguyên lý: Từ kết quả tính nhạy giữa kháng sinh và Nano bạc trong phòng thí nghiệm, bố trí thí nghiệm để kiểm chứng với cá bị cảm nhiễm không được điều trị thuốc và cá không bị cảm nhiễm.
1. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Khoa Thuỷ sản, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Hệ thống bể thí nghiệm (96L) được khử trùng bằng chlorine, rửa lại bằng nước sạch. Sau đó cho nước vào bể và lắp hệ thống sục khí liên tục vài ngày để loại hết chlorine, các chỉ tiêu môi trường nước được kiểm tra trước khi tiến hành thí nghiệm gồm pH, nhiệt độ, NH3, DO.
Thí nghiệm cảm nhiễm thăm dò LD50
Cá Nheo mỹ được nuôi thuần hoá trong 7 ngày ở 21 bể thí nghiệm có thể tích 96L, mỗi bể thí nghiệm bố trí 10 con cá. Các yếu tố môi trường trong suốt quá trình thí nghiệm được kiểm soát với nhiệt độ dao động từ 25 – 28 0C, pH 6,5 – 8,5 đây là điều kiện môi trường tối ưu cho sự phát triển của các loài cá và sự bùng phát dịch bệnh theo mùa ở miền Bắc Việt Nam (Vân, 2007). Cá được gây cảm nhiễm bằng cách tiêm vi khuẩn trong màng bụng (0,1ml vi khuẩn/cá với độ pha loãng 100 – 10-5 CFU/ml), bể đối chứng được tiêm bằng nước muối sinh lý, ở mỗi nồng độ vi khuẩn được bố trí lặp lại 3 lần. Sau khi tiêm, biểu hiện của cá được theo dõi liên tục trong 7 ngày. Những cá có dấu hiệu lờ đờ, bơi lội kém linh hoạt được thu để giải phẫu quan sát dấu hiệu bệnh và tái phân lập vi khuẩn từ thận. Mật độ vi khuẩn gây nhiễm 50% cá thí nghiệm (LD50) xác định được từ thí nghiệm thăm dò sẽ được sử dụng để gây cảm nhiễm cá bố trí ở thí nghiệm điều trị bệnh bằng Florphenicol và Nano bạc.
+ Thí nghiệm điều trị được bố trí gồm 5 công thức (CT), mỗi CT lặp lại 3 lần:
Nghiệm thức thí nghiệm CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 (Đối chứng)
Các CT1, CT2, CT3, CT4, Cá được gây cảm nhiễm vào ngày 0 và được cho ăn thức ăn trộn với thuốc từ ngày đầu tiên có biểu hiện bệnh lý (từ 48 giờ sau khi tiêm vi khuẩn) và cho ăn liên tục trong 7 ngày. CT5 đối chứng: Cá được gây cảm nhiễm vào ngày 0 và được cho ăn thức ăn không trộn thuốc.
Cá sau khi cảm nhiễm có các biểu hiện đặc trưng của bệnh như mất nhớt, khô ráp, da bị xuất huyết, xuất hiện các đốm xuất huyết trên thân, gốc vây, quanh miệng, hậu môn. Mắt lồi đục, bụng chướng to, các vây xơ rách. Cá được mổ khám, lấy mẫu cấy trên môi trường TSA đặc trưng và xem hình thái khuẩn lạc, nhuộm Gram, dùng phương pháp PCR để xác định vi khuẩn.
Phương pháp PCR để xác định chủng vi khuẩn Aeromonas veronii gây bệnh cho cá sau khi cảm nhiễm: Sử dụng cặp mồi 16S ARN gen với kích thước 461 bp để xác định họ Aeromonas và cặp mồi rpoB với kích thước 224bp để xác định loài
A. veronii. Chu kỳ nhiệt thực hiện phản ứng là 95oC trong 4 phút, sau đó 94oC trong 30 giây lặp lại chu kỳ 30 lần, 55oC trong 30 giây, 72oC trong 2 phút, và kéo dài cuối cùng ở 72oC trong 7 phút. Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại được điện di trên gel 1% agarose trong dung dịch đệm TBE . Kết quả điện di được ghi nhận bằng bàn đọc UV.
Trong quá trình thí nghiệm pH và nhiệt độ được ghi nhận hàng ngày lúc 6 giờ và 14 giờ. Số lượng và tỷ lệ cá chết cũng được ghi nhận mỗi ngày. Tất cả cá còn sống sau thí nghiệm cũng được phân lập vi khuẩn xác nhận tình trạng nhiễm khuẩn. Thời gian thí nghiệm là 14 ngày. Hiệu quả điều trị bệnh trong phòng thí nghiệm được đánh giá bằng tỉ lệ sống tương đối (relative survival rate – RPS).