Thời gian sau khi cá được cảm nhiễm và bắt đầu chết là 2 ngày ở nghiệm thức tiêm vi khuẩn với độ pha loãng 100 CFU/ml. Tỉ lệ cá chết là 100% sau 3 ngày. Ở nghiệm
thức tiêm vi khuẩn với độ pha loãng 10-1 CFU/ml thì các bắt đầu chết sau 2 ngày cảm nhiễm và đạt 100 % sau 5 ngày. Cuối thí nghiệm tỉ lệ cá chết 13,33% ở nghiệm thức tiêm vi khuẩn với độ pha loãng là 10-2 và 26,67% ở nghiệm thức tiêm 10-3. Các nghiệm thức tiêm vi khuẩn với độ pha loãng 10-4 và 10-5 cá bắt đầu chết sau 3 ngày cảm nhiễm. Sau 7 ngày, tỉ lệ cá chết ở các nghiệm thức này lần lượt là 53,33%, 76,67%. Cá ngừng chết từ ngày thứ 7 sau cảm nhiễm đến khi kết thúc thí nghiệm.
Tỷ lệ chết của cá trong thí nghiệm và xác định liều LD50 của vi khuẩn
Aeromonas veronii được biểu thị trong bảng 4.1 và hình 4.3.
Bảng 4.3. Tỷ lệ cá chết thí nghiệm thăm dò LD50Độ pha loãng Độ pha loãng (CFU/ml) 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 ĐC
Từ kết quả tỷ lệ cá chết tương ứng với các độ pha loãng vi khuẩn, ta có phương trình Số c á ch ết 35 30 20 15 10 5 0 0 50000000 100000000 150000000 Nồng độ vi khuẩn Hình 4.3. Phương trình LD50
Từ kết quả thí nghiệm gây cảm nhiễm xác định được giá trị LD50 của chủng vi khuẩn Aeromonas veronii ở cá Nheo mỹ là 1,48x105 CFU/ml.
4.3. KẾT QUẢ THEO DÕI TỶ LỆ SỐNG CỦA CÁ NHEO MỸ SAU KHIĐIỀU TRỊ BỆNH TRONG QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM ĐIỀU TRỊ BỆNH TRONG QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM
Tỷ lệ sống của cá sau quá trình điều trị thể hiện khả năng trị bệnh của thuốc với vi khuẩn, sau 7 ngày theo dõi thí nghiệm cảm nhiễm có thể thấy tỉ lệ sống của cá là khá cao. Điều đó được biểu thị trong hình 4.4.
T ỷ lệ s ốn g (% ) 100.00 90.00 60.00 50.00 40.00 1 2 3 4 5 6 7 Ngày nuôi
Hình 4.4. Tỷ lệ sống của cá Nheo mỹ sau cảm nhiễm và điều trị
Cá sau khi cảm nhiễm có dấu hiệu bơi chậm, ăn ít, sau 2 ngày bắt đầu có dấu hiệu xuất huyết ở miệng, gốc vây ngực, hậu môn. Cá chết có biểu hiện mất nhớt, khô ráp, da bị xuất huyết, xuất hiện các đốm xuất huyết trên thân, gốc vây, quanh miệng, hậu môn. Mắt lồi đục, bụng chướng to, các vây xơ rách. Các dấu hiệu đặc trưng cho
Hình 4.5. Bệnh tích của cá Nheo mỹ sau cảm nhiễm vi khuẩn A.veronii
Cá chết sau khi cảm nhiễm được phân lập chủng vi khuẩn, ứng dụng phương pháp sinh học phân tử giải trình tự đoạn gen 16S-rRNA và PCR để giám định và phát hiện gen rpo B đặc hiệu của Aeromonas veronii theo Trương Đình Hoài & cs. (2019). Kết quả thu được, các mẫu cá bị chết đều cho kết quả dương tính với vi khuẩn Aeromonas veronii.
461 bp 224 bp
Qua kết quả ở đồ thị 4.4 cho ta thấy, ở cùng một thời điểm thì nồng độ kháng sinh càng cao thì tỉ lệ chết của cá càng giảm. Cá chết bắt đầu từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 5 sau cảm nhiễm và ngưng hẳn từ ngày thứ 6 trở đi. Như vậy, có thể kết luận rằng sau 4 đến 5 ngày tuỳ thuộc vào nồng độ thuốc vi khuẩn đã mất tác dụng gây chết lên cá. Tỷ lệ sống của cá được biểu thị trong bảng 4.3.
Bảng 4.4. Tỷ lệ sống của cá Nheo mỹ sau điều trị thử nghiệm
Nghiệm thức CT1 CT2 CT3 CT4 ĐC
M ± SD: trung bình mẫu ± độ lệch chuẩn; các ký tự a, b thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm trong cùng một cột (p < 0.05).
Kết quả thí nghiệm điều trị cho thấy, cá ở nghiệm thức đối chứng cho ăn thức ăn không trộn thuốc có tỷ lệ sống thấp nhất 56.6 % và cao nhất ở CT1 với tỷ lệ sống đạt 83.3 %. Tiếp đến là CT2 và CT3 đạt 80 %. Như vậy, khi nồng độ kháng sinh giảm từ 15 ppm xuống 10 ppm + Nano bạc 5 ppm và Flophenicol 5 ppm + Nano bạc 10 ppm thì tỷ lệ sống giảm từ 83,3% xuống 80%, tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p>0.05). Như vậy có thể kết luận rằng: sau 7 ngày thí nghiệm với 3 lần lặp thì số lượng cá còn sống ở các bể thử thuốc đều có kết quả cao hơn bể ĐC và ở các bể thí nghiệm khác nhau đều có sự chênh lệch.
Sau khi kết thúc thí nghiệm, cá được theo dõi tiếp đến 10 ngày để kiểm tra khả năng tái phát của bệnh. Tất cả cá còn sống sau thí nghiệm được thu mẫu thận và chọn ngẫu nhiên để xác định tình trạng nhiễm khuẩn bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường TSA, kết quả khi nuôi cấy đều không thấy xuất hiện vi khuẩn.
Gaunt và cs, 2003 thử nghiệm Florphenicol điều trị nhiễm khuẩn do E. ictaluri trên cá nheo mỹ khi sử dụng các liều 10, 20, 40 mg/kg trọng lượng, chocá ăn trong 5 ngày liên tục kết quả thu được cá có tỷ lệ sống đạt được 100, 98.75, 98.75% ở các lô thí nghiệm. Tuy nhiên đến năm 2004 khi sử dụng florphenicol điều trị bệnh nhiễm khuẩn E. ictaluri trên cá Nheo mỹ khi sử dụng với liều 10mg/kg trọng lượng sau 10 ngày điều trị, tỷ lệ sống đạt 86 % như vậy nếu dùng Florphenicol về lâu dài sẽ xảy ra hiện tượng kháng thuốc, tỷ lệ sống của cá giảm từ 100% xuống còn 86%.
Bên cạnh đó, kết quả khảo nghiệm nuôi tôm thẻ chân trắng của ĐH nông lâm TP HCM cho thấy sau 53 ngày nuôi có sử dụng nano bạc số tôm còn sống sau 53 ngày nuôi là 83 % trong khi đó bể đối chứng tỷ lệ sống còn 0%. Như vậy nano bạc khi sử dụng để xử lý bệnh nhiễm khuẩn trong nuôi tôm có hiệu quả và việc kết hợp giữa Nano bạc và florphenicol trong xử lý các bệnh nhiễm khuẩn trên một số đối tượng thuỷ sản cho kết quả khả quan.
Cho tới nay, kết quả nghiên cứu về tương tác giữa kháng sinh và Nano bạc chưa được công bố, chính vì thế cơ chế của quá trình cộng hợp này chưa được làm sáng tỏ. Tuy nhiên với những kết quả nghiên cứu bước đầu thấy được sự kết hợp này có ý nghĩa, giảm lượng kháng sinh sử dụng, tránh tồn dư kháng sinh trong sản phẩm thuỷ sản, giảm chi phí sử dụng kháng sinh. Như vậy đây sẽ là xu hướng mới được lựa chọn trong việc điều trị bệnh nhiễm khuẩn trên động vật thuỷ sản.
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
5.1. KẾT LUẬN
Khi kết hợp giữa kháng sinh Florphenicol với nano bạc có tác dụng diệt khuẩn tốt như khi dùng kháng sinh đơn cụ thể: vòng vô khuẩn đạt 33 mm khi sử dụng kháng sinh, vòng vô khuẩn giảm xuống 31,8 mm và 25,3 mm khi kết hợp giữa kháng sinh và Nano bạc.
Thử nghiệm tác dụng của kháng sinh florphenicol kết hợp với Nano bạc trong Invivo có thể điều trị được bệnh xuất huyết trên cá Nheo mỹ do vi khuẩn A. veronii gây ra cụ thể: Cá ở nghiệm thức đối chứng cho ăn thức ăn không trộn thuốc có tỷ lệ sống 56.6%, tuy nhiên khi cá được cho ăn thức ăn trộn thuốc và Nano bạc thì tỷ lệ sống tăng lên rõ rệt 80%. Từ đó ta có thể kết hợp giữa kháng sinh và nano bạc để giảm nồng độ của kháng sinh, giảm được chi phí, hạn chế tồn dư kháng sinh đồng thời giảm thiểu thiệt hại mà an toàn với sức khoẻ cá, với môi trường nuôi và sức khoẻ của người tiêu dùng.
5.2. ĐỀ XUẤT
Trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy một số vùng nuôi khi phân lập vi khuẩn và thử kháng sinh đồ thấy xuất hiện hiện tượng kháng kháng sinh vì vậy cần mở rộng nghiên cứu thêm các loại thuốc mới thay thế cho những loại thuốc bị cấm sử dụng và những thuốc có khả năng kháng với vi khuẩn.
Tiếp tục có những nghiên cứu chuyên sâu về Nano bạc đối với cá nhiễm bệnh, không chỉ là vi khuẩn Aeromonas veronii mà còn nhiều loài vi khuẩn gây bệnh khác, nghiên cứu trên các đối tượng khác như các loài cá khác, tôm, ếch... Nghiên cứu giải thích cơ chế tác động của nano bạc với vi khuẩn và sự cộng hợp với kháng sinh.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Abbott S. L., Wendy K. W. C. & Michael Janda J. (2003). The Genus Aeromonas: Biochemical Characteristics, Atypical Reactions, and Phenotypic Identification Schemes. J. of Clin. Micro. 41. 6. 2348–2357.
Aberoum A. & Jooyandeh H. (2010). A review on occurrence and characterization of the Aeromonas species from marine fishes. World Journal of Fish and Marine Sciences. 2. 519-523.
Akinbowale O.L., Peng H. & Barton M.D. (2006). Antimicrobial resistance in bacteria isolated from aquaculture sources in Australia. Journal of Applied Microbiology, 100. 1103-1113.
Alcaide A., Blasco M.D. & Esteve C. (2005). Occurrence of drug-resistant bacteria in two European eel farms. Applied and Environmental Microbiology. 71. 3348-3350. Aoki T. & Takahashi A. (1987). Class D tetracycline resistance determinants of R
plasmids from the fish pathogens Aeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda, and Pasteurella piscicida. Antimicrob. Agents and Chemother. 31. 1278-1280. Aoki T. (1988). Drug resistance plasmids from fish pathogens. Microbiol. Sci. 5. 219- 223. Austin B. & Austin D.A. (1999). Bacterial Fish Pathogens, 3th edn. Chichester. Baltimore T., Tajima K. & Shariff M. (1993). Numerical taxonomy and virulence
screening of Aeromonas spp. isolated from healthy and epizootic ulcerative syndrome-positive fishes. Asian Fisheries Sciences. 6. 11–16.
Barrow G.I. & Feltham R.K.A. (1993). Covan and Steel's manual for the identification of medical bacteria, 3nd edn. Cambridge University Press, Cambridge.
Beaz-Hidalgo R., Martínez-Murcia A. & Figueras M.J. (2013). Reclassification of Aeromonas hydrophila subsp. dhakensis Huys 2002 and Aeromonas aquariorum MartínezMurcia 2008 as Aeromonas dhakensis sp. nov. comb nov. and emendation of the species Aeromonas hydrophila. Systematic and Applied Microbiology, 36: 171-176.
Bùi Quang Tề & Vũ Thị Tám (2000). Những bệnh thường gặp ở tôm cá và biện pháp phòng trị. Nhà xuất bản Nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh.
Bùi Quang Tề (2002). Nghiên cứu lựa chọn bước đầu các chất thay thế một số hoá chất và kháng sinh cấm sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản, Báo cáo tổng kết đề tài, Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I, Bắc Ninh.
Bùi Quang Tề (2006). Nghiên cứu xây dựng giải pháp kỹ thuật nuôi tôm sú, cá Tra, cá Ba sa đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm. Báo cáo tổng kết đề tài KC-06-20NN, Viện nghiên cứu Nuôi trồng thuỷ sản I, Bắc Ninh.
Châu T.T. (2007). Kháng kháng sinh của serovar Salmonella entericaStyphi ở Châu Á và chế phân tử giảm nhạy cảm với fluoroquinolones. Tạp chí kháng sinh. chương 51, 43.15-23.
Chelossi E., Vezzulli L., Milano A., Branzoni M., Fabiano M., Ricarrdi G. & Banat I.M. (2003). Antibiotic resistance of benthic bacteria in fish farm and control sediments of Western Mediterranean. Aquaculture, 219. 83-97.
Chen P.J., Tan S.W. & Wu W.L. (2012). Stabilization or oxidation of nanoscale zerovalent iron at environmentally relevant exposure changes bioavailability and toxicity in medaka fish. Environ. Sci. Technol. 46. 8431-8439.
Chen X. & Schluesener H.J. (2008). Nanosilver: a nanoproduct in medical application/ Toxicol. Lett. 176.1 – 12.
Clinical L. & Standards I. (CLSI) (2014). Methods for Antimicrobial Disk Susceptibility Testing of Bacteria Isolated from Aquatic Animals, Approved Guideline VET-03A. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, NJ. 26 (03).
Dallaire-Dufresne S., Tanaka K.H., Trudel M.V., Lafaille A. & Charette S.J. (2014). Virulence, genomic features, and plasticity of Aeromonas salmonicida sub sp. salmonicida, the causative agent of fish furunculosis. Veterinary Microbiology, 169. 1-7.
Đặng Thị Hoàng Oanh, Nguyễn Thanh Phương, Temdoung S., Chinabut S., Yussoff F., Shariff M., Bartie K., Huys G., Giacomini M., Berton S., Swings J. & Teale A. (2005). Xác định tính kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn phân lập từ các hệ thống nuôi thủy sản ở Đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam. Tạp chí Nghiên cứu Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ. 4. 136-144.
DePaola A., Flynn P.A., McPhearson R.M. & Levy S.W. (1988). Phenotypic and genotypic characterization of tetracycline-and oxytetracycline-resistant Aeromonas hydrophila from cultured channel catfish (Ictalurus punctatus) and their environments. Appl. Environ. Microbiol. 54:1861–1863.
DePaola A., Peeler J. T. & Rodrick G.E. (1995). Effect of oxytetracycline –medicated feed on antibiotic resistance of gram-negative bacteria in catfish ponds. Appl. Environ. Microbiol. 61:2335-2340.
Dowling P.M. (2006). Chloramphenicol, thiamphenicol and florfenicol. In: S. Giguère, J. F. Prescott, D. Baggot, R D. Walker and P.M. Dowling (ed.), Antimicrobial Therapy in Veterinary Medicine. Blackwell Publishing Ltd, Oxford, pp. 241-248.
Dung T.T., Galina Z., Oanh D.T.H., Jeney Z. & Tuan N.A. (1997). Results of the baseline survey on fish health management in freshwater aquaculture of the Mekong Delta, Vietnam. WES newsletter No. 6. Esteve, C., C. Amaro, et al. 1995. Pathogenicity of live bacteria and extracellular products of motile Aeromonas isolated from eels. J. of App. Bact. 78, 555–562.
ETC (2015). Down on the Farm: The Impact of Nanoscale Technologies on Food and Agriculture, 2003. Firdhouse, M. J., & Lalitha P. (2015). Biosynthesis of silver nanoparticles and its applications. Journal of Nanotechnology.
Galdiero S., Falanga A. & Vitiello M. (2011). Silver nanoparticles as potential antiviral agents/ Molecules. 16. 8894 – 8918.
Ge L., Li Q. & Wang M. (2014). Nanosilver particles in medical application: synthesis, performance, and toxicity/ Int. J. Nanomedicine. 2399 - 2407.
GEAMP (Joint Group of Experts5 on the Scientific Aspects of Marine Environmental Protection). (1997). Towards safe and effective use of chemicals in coastal aquaculture. Report and studies.65. FAO, Rome. 40.
Giraud E., Cloeckaert A., Kerboeuf D. & Chaslus-Dancla E. (2000). Evidence for active efflux as the primary mechanism of resistance to ciprofloxacin in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Antimicrobial agents and chemotherapy. 44(5): 1223-1228.
Graslund S., Holmstrom. K & Wahlstrom A. (2003). Afield survey of chemicals and biological products use in shrimp farming. Marine pollution Bulletin. 11. 89 – 90. Hatha M., Vivekanandam A.A., Joice G.J. & Christol G.J. (2005). Antibiotic resistance
pattern of motile aeromonads from farm raised freshwater fish. International Journal of Food Microbiology. 98. 131-134.
Ho S.P., Hsu T.Y., Chen M.H. & Wang W.S. (2000). Antibacterial effects of chloramphenicol, thiamphenicol and florfenicol against aquatic animal bacteria. The Journal of Veterinary Medical Science. 62. 479-485.
Ho S.P., Hsu T.Y., Chen M.H. & Wang W.S. (2000). Antibacterial effect of chloramphenicol, thiamphenicol and florfenicol against aquatic animal bacteria. J. Vet. Med. Sci. 62:479-485.
Hoai T.D., Trang T.T., Van Tuyen N., Giang N.T.H. & Van V. K. (2019). Aeromonas veronii caused disease and mortality in channel catfish in Vietnam. Aquaculture. 513. 734425. Hoàng Triều (2018). Nuôi tôm chân trắng bằng công nghệ nano. Truy cập từ
http://baothuathienhue.vn/nuoi-tom-chan-trang-bang-cong-nghe-nano- a63783.html ngày 12/8/2020.
Hứa Thị Phượng Liên (1998). Nghiên cứu bệnh xuất huyết trên vi, xoang miệng cá Basa (Pangasius bocourti) nuôi bè tại An Giang. Luận văn Thạc sĩ ngành Nuôi trồng thủy sản. Huang L.Q., Xu Y. & Guo S.L. (2010). Disinfecting aquatic pathogenic bacteria by
photocatalytic activity with nanometer TiO2. J Jimei Univ (Nat Sci) 4:54–57. doi:10.3969/j.issn.1007-7405.2010.04.003, In Chinese with English abstract. Huang S., Ling W., Lianmeng L., Yuxuan H. & Lu L. (2014). Nanotechnology in
Agriculture, Livestock and Aquaculture in China. A review. Agron. Sustain. Dev., DOI10.1007/s 13593-014-0274-x.
Huys G. & Kampfer P. (1997). Aeromonas popoffii sp.nov., a mesophilic bacterium isolated from drinking water production plants and reservoirs. Int. J. of Syst. Bact. 47: 1165-1171.
Huys G., R. Coopman P. J. & Kersters K. (1996). Highresolution genotypic analysis of the genus Aeromonas by AFLP fingerprinting. Int. J. of Syst. Bact. 46. 572–580.
James H. T. & Geoff L. A. (2001). Fishes as food: aquaculture’s contribution. Embo Rep. 21. 958-963.
Janda J.M. & Abbott (1996). Further studies on biochemical characteristics and serologic properties of the genus Aeromonas. J. of Clin. Micro. 34. 1930–1933. Jeon I. Y. & Baek J. B. (2010). Nanocomposites derived from polymers and inorganic
nanoparticles. Materials. 3(6): 3654-3674.
Juarez-Moreno K., Mejia-Ruiz C.H. & Diaz F. (2017). Effect of silver nanoparticles on the metabolic rate, hematological response, and survival of juvenile white shrimp Litopenaeus vannamei/ Chemosphere. 169. 716 – 724.
Kerry J., Hiney M., Coyne R., Nicgabhainn S., Gilroy D., Cazabon D. & Smith P. (1995). Fish feed as a source of oxytetracycline-resistant bacteria in the sediments under fish farms. Aquaculture. 131. 101-113.
Keyes K., Hudson C. & Maurer J.J. (2000). Detection of florphenicol resistance genes in Escherichia coli isolated from sick chickens. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44. 421-424.
Khardori N. & V. Fainstein (1988). Aeromonas and Plesiomonas as etiological agents.