3.4.1. Tính nhạy của vi khuẩn Aeromonas veronii với kháng sinh Florphenicol và Nano bạc và Nano bạc
Mục đích: Xác định được khả năng kháng khuẩn của kháng sinh và Nano bạc đối với vi khuẩn A. veronii.
Nguyên lý: Phương pháp kháng sinh đồ dựa trên sự khuếch tán của kháng sinh trên thạch đĩa của Kirby-Bauer (Bauer & cs., 1966), dựa trên đường kính vòng vô khuẩn theo tiêu chuẩn của Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (2007). Các bước tiến hành:
1, Thí nghiệm gồm 5 công thức (CT), mỗi CT được bố trí lặp lại ba lần, liều lượng sử dụng như sau: Công thức thí nghiệm CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 (Đối chứng)
2, Vi khuẩn gốc được phân lập từ cá nhiễm bệnh do Aeromonas veronii và lưu trữ tại bộ môn Môi trường và bệnh thuỷ sản – Khoa Thuỷ sản Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Sau đó được nuôi tăng sinh trong môi trường Nutrient Broth (NB) trong 20-24 giờ ở nhiệt độ 28 – 300C.
3, Đĩa thạch TSA được chuẩn bị trước cấy 100 µl vi khuẩn A.veronii trên có mật độ 0.26 x 109 cfu/mL, trang đều cho khô.
4, Đặt lên mỗi đĩa 2 khoanh giấy có độ dày 0,5 mm, đường kính 4mm đã được vô trùng sao cho mặt khoanh giấy áp sát vào mặt môi trường.
5, Nhỏ lượng kháng sinh và Nano bạc 10 µl/một đĩa giấy đối với từng công thức thí nghiệm.
6, Để đĩa thạch trong tủ ấm 300C. Vòng vô khuẩn được quan sát và đo sau 24h. 3.4.2. Điều trị bệnh do vi khuẩn Aeromonas veronii trong phòng thí nghiệm Thời gian thí nghiệm: từ 09/07 – 31/07/2020
Mục đích: Kiểm chứng xem khi kết hợp kháng sinh với Nano bạc có thể điều trị được bệnh do vi khuẩn A. veronii gây ra trên cá Nheo mỹ.
Nguyên lý: Từ kết quả tính nhạy giữa kháng sinh và Nano bạc trong phòng thí nghiệm, bố trí thí nghiệm để kiểm chứng với cá bị cảm nhiễm không được điều trị thuốc và cá không bị cảm nhiễm.
1. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Khoa Thuỷ sản, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Hệ thống bể thí nghiệm (96L) được khử trùng bằng chlorine, rửa lại bằng nước sạch. Sau đó cho nước vào bể và lắp hệ thống sục khí liên tục vài ngày để loại hết chlorine, các chỉ tiêu môi trường nước được kiểm tra trước khi tiến hành thí nghiệm gồm pH, nhiệt độ, NH3, DO.
Thí nghiệm cảm nhiễm thăm dò LD50
Cá Nheo mỹ được nuôi thuần hoá trong 7 ngày ở 21 bể thí nghiệm có thể tích 96L, mỗi bể thí nghiệm bố trí 10 con cá. Các yếu tố môi trường trong suốt quá trình thí nghiệm được kiểm soát với nhiệt độ dao động từ 25 – 28 0C, pH 6,5 – 8,5 đây là điều kiện môi trường tối ưu cho sự phát triển của các loài cá và sự bùng phát dịch bệnh theo mùa ở miền Bắc Việt Nam (Vân, 2007). Cá được gây cảm nhiễm bằng cách tiêm vi khuẩn trong màng bụng (0,1ml vi khuẩn/cá với độ pha loãng 100 – 10-5 CFU/ml), bể đối chứng được tiêm bằng nước muối sinh lý, ở mỗi nồng độ vi khuẩn được bố trí lặp lại 3 lần. Sau khi tiêm, biểu hiện của cá được theo dõi liên tục trong 7 ngày. Những cá có dấu hiệu lờ đờ, bơi lội kém linh hoạt được thu để giải phẫu quan sát dấu hiệu bệnh và tái phân lập vi khuẩn từ thận. Mật độ vi khuẩn gây nhiễm 50% cá thí nghiệm (LD50) xác định được từ thí nghiệm thăm dò sẽ được sử dụng để gây cảm nhiễm cá bố trí ở thí nghiệm điều trị bệnh bằng Florphenicol và Nano bạc.
+ Thí nghiệm điều trị được bố trí gồm 5 công thức (CT), mỗi CT lặp lại 3 lần:
Nghiệm thức thí nghiệm CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 (Đối chứng)
Các CT1, CT2, CT3, CT4, Cá được gây cảm nhiễm vào ngày 0 và được cho ăn thức ăn trộn với thuốc từ ngày đầu tiên có biểu hiện bệnh lý (từ 48 giờ sau khi tiêm vi khuẩn) và cho ăn liên tục trong 7 ngày. CT5 đối chứng: Cá được gây cảm nhiễm vào ngày 0 và được cho ăn thức ăn không trộn thuốc.
Cá sau khi cảm nhiễm có các biểu hiện đặc trưng của bệnh như mất nhớt, khô ráp, da bị xuất huyết, xuất hiện các đốm xuất huyết trên thân, gốc vây, quanh miệng, hậu môn. Mắt lồi đục, bụng chướng to, các vây xơ rách. Cá được mổ khám, lấy mẫu cấy trên môi trường TSA đặc trưng và xem hình thái khuẩn lạc, nhuộm Gram, dùng phương pháp PCR để xác định vi khuẩn.
Phương pháp PCR để xác định chủng vi khuẩn Aeromonas veronii gây bệnh cho cá sau khi cảm nhiễm: Sử dụng cặp mồi 16S ARN gen với kích thước 461 bp để xác định họ Aeromonas và cặp mồi rpoB với kích thước 224bp để xác định loài
A. veronii. Chu kỳ nhiệt thực hiện phản ứng là 95oC trong 4 phút, sau đó 94oC trong 30 giây lặp lại chu kỳ 30 lần, 55oC trong 30 giây, 72oC trong 2 phút, và kéo dài cuối cùng ở 72oC trong 7 phút. Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại được điện di trên gel 1% agarose trong dung dịch đệm TBE . Kết quả điện di được ghi nhận bằng bàn đọc UV.
Trong quá trình thí nghiệm pH và nhiệt độ được ghi nhận hàng ngày lúc 6 giờ và 14 giờ. Số lượng và tỷ lệ cá chết cũng được ghi nhận mỗi ngày. Tất cả cá còn sống sau thí nghiệm cũng được phân lập vi khuẩn xác nhận tình trạng nhiễm khuẩn. Thời gian thí nghiệm là 14 ngày. Hiệu quả điều trị bệnh trong phòng thí nghiệm được đánh giá bằng tỉ lệ sống tương đối (relative survival rate – RPS).
3.5. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Số liệu được xử lí trên SPSS 18, so sánh phương sai 1 nhân tố, kiểm định sai khác theo LSD với mức ý nghĩa P < 0,05.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. TÍNH NHẠY CỦA VI KHUẨN AEROMONAS VERONII VỚI KHÁNG
SINH FLORPHENICOL VÀ NANO BẠC
Đánh giá tác dụng diệt khuẩn của Florphenicol và Nano bạc đối với vi khuẩn
Aeromonas veronii (Hình 4.1) cho thấy kháng sinh và khi kết hợp kháng sinh với Nano bạc, đều có khả năng diệt khuẩn. Tuy nhiên, khi sử dụng Nano bạc khả năng diệt khuẩn chỉ xuất hiện trong thời gian 4 giờ đầu (vòng vô khuẩn đạt 12 mm), sau 24 giờ Nano bạc mất tác dụng, không thấy xuất hiện vòng vô khuẩn. Điều này có thể được giải thích rằng do Nano bạc hoạt động theo cơ chế ion hoá nên giai đoạn này vi khuẩn bị ức chế do tác dụng của các ion bạc được giải phóng từ hạt nano bạc. Tuy nhiên cấu trúc tế bào của vi khuẩn vẫn chưa bị phá huỷ do chưa đủ lượng, nên lúc hết ion bạc vi khuẩn lại phát triển bình thường.
NaAg+ 15 ppm
Fl 10 + NaAg+ 5 (ppm) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 4.1. Kháng sinh đồ Florphenicol và Nano bạc
Bên cạnh đó, khi kết hợp kháng sinh và Nano bạc thì khả năng diệt khuẩn giảm đi không đáng kể. Kết quả so sánh sự sai khác về đường kính vòng vô khuẩn trung bình được phân tích qua LSD cho thấy đã có sự sai khác về đường kính vòng vô khuẩn trung bình. Nếu vòng vô khuẩn đạt 33 ± 0,5 mm khi sử dụng nồng độ 15 ppm Florfenicol thì vòng vô khuẩn chỉ giảm xuống 31,8 ± 0,76 mm khi dùng kết hợp 10 ppm Florfenicol + 5 ppm Nano bạc và 25,3 ± 0,57 mm khi kết hợp 5 ppm Florfenicol + 10ppm Nano bạc. Điều này chứng tỏ khi kết hợp kháng sinh Florphenicol và Nano bạc có tác dụng diệt khuẩn tốt như khi sử dụng kháng sinh thông thường.
Bảng 4.1. Đường kính vòng vô khuẩn của kháng sinh Florphenicol và Nano bạc đối với vi khuẩn A.veronii
Công thức CT1 CT2 CT3 CT4 ĐC
Chú thích: M ± SD: trung bình mẫu ± độ lệch chuẩn; các ký tự a, b thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm trong cùng một cột (p < 0.05). (--) Không có vòng vô khuẩn
Theo Bùi Quang Tề (1997) việc sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh do vi khuẩn thường gây ra hiện tượng nhờn thuốc, kháng thuốc. Bên cạnh đó, việc sử dụng kháng sinh dễ gây hại cho sức khoẻ của người tiêu dùng do việc tồn dư kháng sinh trong cơ thể động vật thuỷ sản (Nguyễn Xuân Bách, 2014). Aeromonas veronii là những vi khuẩn gây bệnh phổ biến trên các loài cá Nheo mỹ, gây cá chết hàng loạt, tỷ lệ tử vong lên 40-60% với cá có trọng lượng 1-2 kg (Trương Đình Hoài, 2019), đối với cá Nheo mỹ giai đoạn giống có thể lên đến 100 % và kháng nhiều kháng sinh mạnh. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của Nano bạc đã vạch ra hướng mới “nghiên cứu sử dụng các loại vật liệu Nano thay thế cho kháng sinh điều trị bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn gây ra”. Vì vậy, việc sử dụng hệ vật liệu Nano trong chữa bệnh nhiễm khuẩn sẽ đem đến hiệu quả tích cực: hạn chế sử dụng kháng sinh tân dược, tăng hiệu quả tác động lên tế bào tác nhân gây bệnh, là một giải pháp hữu ích và bảo đảm an toàn cho sản phẩm thuỷ sản.
4.2. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM ĐIỀU TRỊ BỆNH DO VI KHUẨN
AEROMONAS VERONII QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM 4.2.1. Biến động các yếu tố môi trường
Các yếu tố môi trường ảnh hưởng khá lớn đến sự sinh trưởng phát triển và miễn dịch của cá. Trong quá trình thí nghiệm các thông số môi trường được đo bằng máy và được thể hiện cụ thể trong bảng 4.2:
Bảng 4.2. Các yếu tố môi trường trong thời gian thí nghiệm
Chỉ tiêu Sáng Chiều
Nhiệt độ ảnh hưởng khá lớn đến sự phát triển và miễn dịch của cá. Theo Rowland (1986) nhiệt độ thích hợp đối với động vật thủy sản ở vùng nhiệt đới từ 25 – 30oC. Nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của cá là 20- 28oC, nhiệt độ phù hợp sẽ giúp quá trình trao đổi chất, tiêu hóa thức ăn và tốc độ tăng trưởng của cá được ổn định. Giá trị nhiệt độ trong thời gian thí nghiệm là 27,8 – 29,8oC trong thời gian thí nghiệm thì nhiệt độ trung bình giữa các nghiệm thức dao động không lớn trong và
nhiệt độ chênh lệch giữa sáng chiều khoảng ±10oC, cùng với việc bố trí thí nghiệm ở nơi tương đối kín nên sự chênh lệch nhiệt độ giữa sáng và chiều không cao.
Trong quá trình thí nghiệm pH dao động từ 6,7 – 7,8. Theo Swingler (1969) pH = 7 - 8 là môi trường thích hợp cho đa số các loài tôm cá nuôi, khoảng pH thích hợp nhất cho cá phát triển nằm trong khoảng từ 6,5 – 8,5, môi trường không được quá kiềm hoặc quá acid. Do bố trí thí nghiệm sử dụng nước máy đã được sục khí liên tục trong 24 giờ trước khi sử dụng nên hạn chế thay đổi pH và sự chênh lệch pH trung bình giữa các nghiệm thức cũng không lớn. Vì vậy trong thí nghiệm này, giá trị pH là phù hợp cho sự phát triển của cá.
Hệ thống nuôi luôn đảm bảo sục khí 24/24, sục khí ổn định đảm bảo cung cấp đủ oxy cho các bể nuôi. DO luôn dao động trong khoảng từ 6,1 – 6,8 mg/l hoàn toàn phù hợp với ngưỡng DO trong NTTS (Mai Đình Yên, 1979).
Trong quá trình thí nghiệm thì nguồn nước sử dụng cho các nghiệm thức là nước máy, thời gian thí nghiệm ngắn và hàm lượng NH3 ở các nghiệm thức không cao, thấp nhất là 0,0 ppm và cao nhất là 0,5 ppm. Nồng độ này không gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của cá. Kết quả này tương đối ổn định và phù hợp trong mức cho phép.
Như vậy, các yếu tố môi trường được kiểm tra nhìn chung luôn nằm trong ngưỡng thích hợp đối với cá Nheo Mỹ.
4.2.2. Kết quả xác định nồng độ vi khuẩn gốc
Sau 24h cấy trang vi khuẩn Aeromonas veronii với độ pha loãng 10-6 từ dung dịch gốc ban đầu (pha loãng 1000000 lần) thì tiến hành đếm khuẩn lạc, số
khuẩn lạc trên đĩa thạch xác định được là 4 khuẩn lạc, áp dụng công thức tính nồng độ vi khuẩn có thể xác định được mật độ vi khuẩn gốc là 0,26×109 CFU/ml.
4.2.3. Kết quả xác định liều LD50
Cá Nheo mỹ sau quá trình cảm nhiễm vi khuẩn A. veronii ở các độ pha loãng từ 100 – 10-5 CFU/ml và theo dõi trong 7 ngày ta thu được kết quả sau: Không có cá chết ở nghiệm thức đối chứng tiêm nước muối sinh lý, cá ở trạng thái sinh lý bình thường trong suốt thời gian thí nghiệm (tỉ lệ sống của cá là 100%).
Ở các nghiệm thức cảm nhiễm vi khuẩn chủng Aeromonas veronii, cá chết với tỉ lệ tăng dần theo mật độ vi khuẩn cảm nhiễm. Cá chết ở các nghiệm thức cảm nhiễm có dấu hiệu bệnh lý là mất nhớt, khô ráp, da bị xuất huyết, xuất hiện các đốm xuất huyết trên thân, gốc vây, quanh miệng, hậu môn. Mắt lồi đục, bụng chướng to, các vây xơ rách.
Hình 4.2. Bệnh tích của cá sau khi cảm nhiễm vi khuẩn
Thời gian sau khi cá được cảm nhiễm và bắt đầu chết là 2 ngày ở nghiệm thức tiêm vi khuẩn với độ pha loãng 100 CFU/ml. Tỉ lệ cá chết là 100% sau 3 ngày. Ở nghiệm
thức tiêm vi khuẩn với độ pha loãng 10-1 CFU/ml thì các bắt đầu chết sau 2 ngày cảm nhiễm và đạt 100 % sau 5 ngày. Cuối thí nghiệm tỉ lệ cá chết 13,33% ở nghiệm thức tiêm vi khuẩn với độ pha loãng là 10-2 và 26,67% ở nghiệm thức tiêm 10-3. Các nghiệm thức tiêm vi khuẩn với độ pha loãng 10-4 và 10-5 cá bắt đầu chết sau 3 ngày cảm nhiễm. Sau 7 ngày, tỉ lệ cá chết ở các nghiệm thức này lần lượt là 53,33%, 76,67%. Cá ngừng chết từ ngày thứ 7 sau cảm nhiễm đến khi kết thúc thí nghiệm.
Tỷ lệ chết của cá trong thí nghiệm và xác định liều LD50 của vi khuẩn
Aeromonas veronii được biểu thị trong bảng 4.1 và hình 4.3.
Bảng 4.3. Tỷ lệ cá chết thí nghiệm thăm dò LD50 Độ pha loãng (CFU/ml) 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 ĐC
Từ kết quả tỷ lệ cá chết tương ứng với các độ pha loãng vi khuẩn, ta có phương trình Số c á ch ết 35 30 20 15 10 5 0 0 50000000 100000000 150000000 Nồng độ vi khuẩn Hình 4.3. Phương trình LD50 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Từ kết quả thí nghiệm gây cảm nhiễm xác định được giá trị LD50 của chủng vi khuẩn Aeromonas veronii ở cá Nheo mỹ là 1,48x105 CFU/ml.
4.3. KẾT QUẢ THEO DÕI TỶ LỆ SỐNG CỦA CÁ NHEO MỸ SAU KHIĐIỀU TRỊ BỆNH TRONG QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM ĐIỀU TRỊ BỆNH TRONG QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM
Tỷ lệ sống của cá sau quá trình điều trị thể hiện khả năng trị bệnh của thuốc với vi khuẩn, sau 7 ngày theo dõi thí nghiệm cảm nhiễm có thể thấy tỉ lệ sống của cá là khá cao. Điều đó được biểu thị trong hình 4.4.
T ỷ lệ s ốn g (% ) 100.00 90.00 60.00 50.00 40.00 1 2 3 4 5 6 7 Ngày nuôi
Hình 4.4. Tỷ lệ sống của cá Nheo mỹ sau cảm nhiễm và điều trị
Cá sau khi cảm nhiễm có dấu hiệu bơi chậm, ăn ít, sau 2 ngày bắt đầu có dấu hiệu xuất huyết ở miệng, gốc vây ngực, hậu môn. Cá chết có biểu hiện mất nhớt, khô ráp, da bị xuất huyết, xuất hiện các đốm xuất huyết trên thân, gốc vây, quanh miệng, hậu môn. Mắt lồi đục, bụng chướng to, các vây xơ rách. Các dấu hiệu đặc trưng cho
Hình 4.5. Bệnh tích của cá Nheo mỹ sau cảm nhiễm vi khuẩn A.veronii
Cá chết sau khi cảm nhiễm được phân lập chủng vi khuẩn, ứng dụng phương pháp sinh học phân tử giải trình tự đoạn gen 16S-rRNA và PCR để giám định và phát hiện gen rpo B đặc hiệu của Aeromonas veronii theo Trương Đình Hoài & cs. (2019). Kết quả thu được, các mẫu cá bị chết đều cho kết quả dương tính với vi khuẩn Aeromonas veronii.
461 bp 224 bp
Qua kết quả ở đồ thị 4.4 cho ta thấy, ở cùng một thời điểm thì nồng độ kháng sinh càng cao thì tỉ lệ chết của cá càng giảm. Cá chết bắt đầu từ ngày thứ 2