Nguồn: Nanobac KBO
Ngành nuôi trồng thủy sản đã chịu tổn thất to lớn do bệnh vi khuẩn gây ra (Huang & cs., 2010). Sự phát triển nhanh chóng của các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh là một trong những vấn đề nghiêm trọng ảnh hưởng đến tất cả các dạng sống cũng như các loài thủy sản (Swain & cs., 2014; Julio & cs., 2018). Các vi khuẩn của Aeromonas salmonicida, Photobacterium damselae, Yersinia ruckeri, Listeria sp., Vibrio sp., Pseudomonas sp. và Edwardsiella sp. đề kháng với các loại kháng sinh khác nhau đã trở thành một vấn đề ảnh hưởng rất lớn đến hệ thống nuôi ở nhiều quốc gia (Raissy & Ansari, 2011).
Hiện nay, các biện pháp kiểm soát bệnh thuỷ sản chủ yếu dùng phương pháp khử trùng, do vậy các chất khử trùng hóa học, kháng sinh và thuốc sulfa khác nhau thường được sử dụng với số lượng lớn. Chi phí của các loại thuốc hóa học này khá cao, tác dụng mạnh, hiệu quả thấp và có nhiều tác dụng phụ (Yang 2003). Do vậy, sự phát triển của vật liệu nano bằng sự kết hợp của các đại phân tử với các hạt nano vô cơ đã trở thành một trong những lĩnh vực nghiên cứu sáng tạo nhất hiện nay (Jeon & Baek, 2010). Do đặc tính kháng khuẩn hiệu quả và độc tính thấp đối với tế bào động vật, các hạt nano bạc (AgNP) đã trở thành một trong những vật liệu nano được sử dụng phổ biến nhất trong các sản phẩm tiêu dùng (Firdhouse & Lalitha, 2015). Đặc biệt, silica hoặc các hợp chất xốp được trang trí bởi AgNP có chứa silica như gốm sứ, montmorillonite, zeolite, diatomite đã được sử dụng cho mục đích làm sạch nước như chất diệt khuẩn, chất chống đông, chất xúc tác và chất khử độc (Lv & cs., 2009).
Trên thế giới, trong các ngành đánh bắt và nuôi trồng thuỷ sản công nghệ nano đang được ứng dụng để chế tạo nhiều vật liệu, công cụ mới nhằm nâng cao chất lượng, sản lượng, đẩy nhanh tốc độ chẩn đoán bệnh, nâng cao khả năng hấp thụ các loại thuốc như hormon, vắc-xin và các chất dinh dưỡng thiết yếu (Rather
& cs., 2011). Một số nguyên tố vi khoáng kích thước nano như selen, sắt… được sử dụng như một phụ gia thức ăn thủy sản để kích thích tăng trưởng và kháng bệnh, tuy nhiên hướng đi chủ yếu hiện nay là sử dụng công nghệ nano để xử lý nước nhằm kiểm soát bệnh.
Các hạt nano kim loại, chẳng hạn như Fe, FeO, Se, Zn, ZnO, Cu và MgO, v.v. đóng một vai trò quan trọng trong hoạt động nuôi trồng thủy sản. Đã có nghiên cứu cho thấy khi bổ sung nano sắt cho cá chép non, Carassius auratus và cá tầm,
Acipenser gueldenstaedtii tốc độ tăng trưởng của chúng nhanh hơn, 30% và 24% tương ứng (ETC, 2003). Các nguồn Se khác nhau (nano-Se và Selenomethionine) bổ sung chế độ ăn cải thiện sự tăng trưởng, tình trạng chống oxy hóa và nồng độ Se cơ của cá chép Crucian, Carassius auratus gibelio (Zhou & cs., 2009). Trong các nghiên cứu gần đây, bổ sung chế độ ăn uống bởi Zn, nano Zn và Cu giúp đẩy mạnh tốc độ sinh trưởng và phát triển của M. rosenbergii PL (Muralisankar, 2014, 2015, 2016). Hơn nữa, các hạt nano sắt cũng được sử dụng cho các quá trình xử lý nước và đất và nước ngầm (Chen & cs., 2012).
Ônhiễm nguồn nước là tác nhân chính gây tổn thất lớn nhất cho ngành nuôi trồng thủy sản. Hiện tại các phương pháp truyền thống để làm sạch và vô trùng nước vẫn là phương pháp phổ biến, việc sử dụng các hóa chất tẩy trùng, các thuốc kháng sinh và thuốc sulfa không những tốn kém mà còn gây các ảnh hưởng phụ có hại cho sức khỏe của động vật thủy và sản lượng nuôi trồng. Xử lý nước bằng công nghệ nano để làm sạch nguồn nước và ngăn ngừa bệnh thủy sản vừa hiệu quả, an toàn lại vừa tiết kiệm chi phí, đã mở ra một triển vọng rất to lớn cho sự phát triển ngành nuôi trồng thủy sản.
Ở Trung quốc theo Huang & cs., nano-863 (được sản xuất bằng cách trộn vật liệu nano có tính hấp thụ ánh sáng mạnh với chất mang là gốm được nung kết ở nhiệt độ cao) là vật liệu công nghệ cao đang được sử dụng phổ biến để xử lý nước phục vụ sản xuất nông nghiệp, đặc biệt xử lý nước cho nuôi trồng thủy sản. Một thí nghiệm theo dõi trong 6 tháng đã thấy chất lượng nước của ao nuôi sau khi xử lý nano-863 đã được cải thiện rõ rệt, các chỉ tiêu NH3-N, NO2-N, NO3-N và CD của nhóm thí nghiệm thấp hơn 2 lần so với nhóm đối chứng. pH
của nước thuộc nhóm thí nghiệm là 7,2 trong khi đó chỉ tiêu này của nhóm đối chứng là 5,6. Nhờ chất lượng nước được cải thiện mà năng suất nuôi trồng tăng lên. Theo dõi ở một trại giống sản xuất tôm với 1 triệu tôm giống cho mỗi nhóm (nhóm thí nghiệm có nước được xử lý nano-863 còn nhóm đối chứng thì không) đã thấy tỷ lệ sống của tôm nhóm thí nghiệm là 730 ngàn con, trong khi tỷ lệ này của tôm nhóm đối chứng là 360 ngàn con, nghĩa là thấp hơn 2 lần. Nano-863 trong thí nghiệm cũng đã nâng cao hoạt tính của nước, kích thích tôm ăn nhiều và mau lớn, đồng thời có tính kháng khuẩn mạnh, hiệu quả bảo vệ bệnh cho tôm rất cao (Beisel, 1982).
Hiện nay cũng có một vài nghiên cứu đã đánh giá về các tác dụng gây độc hại của các vật liệu nano đến cơ thể của động vật biển, đặc biệt là các nano kim loại và oxit kim loại. Ở thí nghiệm của Juarez-Moreno cùng các cộng sự, khi tiêm nano bạc với các nồng độ 0,50 – 20 ng/µl không gây ảnh hưởng đến sự sống của tôm khi mà tỷ lệ sống sót của các con tôm thí nghiệm đạt 98,7% sau 96h tiêm nano bạc. Những cá thể tôm chết là do chúng không thể vượt qua được quá trình lột xác (Bhaskaram, 1988).
Mặc dù nano bạc đã và đang được sử dụng rộng rãi bởi những tác dụng có lợi của nó như tính kháng khuẩn, kháng nấm và kháng virus, tuy nhiên hiện nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về tác dụng của nano bạc trong việc giảm bớt các vấn đề về sức khoẻ của động vật biển được con người tiêu thụ, ví dụ như tôm thẻ chân trắng L. vannamei (Bhaskaram, 1988). Cũng trong nghiên cứu này, Juarez- Moreno cùng các cộng sự đã chỉ ra rằng việc tiêm nano bạc vào trong tôm không khiến tôm chịu bất cứ 1 áp lực nào đến cơ thể, số lượng tế bào máu tôm trong các nhóm thí nghiệm không có sự khác biệt với nhóm đối chứng. Ngoài ra, cũng trong nghiên cứu này, tác giả đã cho thấy nano bạc có thể sử dụng để chữa bệnh đốm trắng do virus gây ra trên tôm. Kết quả cho thấy, sau khi gây bệnh đốm trắng cho tôm, tỷ lệ sống sót của tôm trong nhóm tôm được tiêm nano bạc với liều lượng 0,5 và 5 ng/µl là 80%, còn ở nhóm tôm được tiêm với liều lượng 20 ng/µl tỷ lệ sống sót là 70% sau 96h. Như vậy, với nghiên cứu này, các nhà khoa học đã mở ra một hướng nghiên cứu mới để sử dụng nano bạc như một phương pháp điều trị an toàn và đầy hứa hẹn, hoặc là tác nhân phòng ngừa nhiễm virus trong các trang trại nuôi trồng thủy sản, với dự kiến sẽ làm giảm thiệt hại kinh tế lớn trong ngành nuôi tôm do tác hại của dịch bệnh (Bhaskaram, 1988).
b. Tình hình nghiên cứu công nghệ Nano ở Việt Nam
Ở Việt Nam, việc ứng dụng công nghệ nano trong thuỷ sản cũng đã được các nhà khoa học và các nhà quản lý chú trọng phát triển. Nano bạc tương tác với lớp protein trên bề mặt vi khuẩn, virus rồi từ đó phá hủy màng tế bào, làm ức chế sự phát triển và tiêu diệt. Nano bạc phòng và diệt nguồn bệnh trong ao nuôi, ổn định màu nước, khử mùi hôi tanh của nước. Đặc biệt đối với những ao có chất thải hữu cơ từ phân gia súc và gia cầm. Áp dụng công nghệ giúp hạn chế cá ăn nổi và các nhiều bệnh có thể gây nguy hiểm cho tôm nuôi. Sử dụng Nano bạc không phụ thuộc vào môi trường nước mặn hay ngọt. Không bị phân hủy ở nhiệt độ cao, là một chất trơ trong môi trường.
Ứng dụng đầu tiên có thể kể đến là các lớp phủ nano polime làm tăng độ bền của lớp bao gói bảo vệ cá fille. Tính chất của lớp bao gói này được nâng cao nhờ sử dụng lớp phủ nano polime trong suốt, có tính kháng khuẩn và ngăn ngừa oxi tiếp xúc với thực phẩm. Các cảm biến nano trên bao bì thực phẩm cũng được dùng để xác định các sai hỏng trong thành phẩm thuỷ sản.
Ở Long An, người nuôi tôm đã được tiếp cận mô hình nuôi tôm ứng dụng công nghệ nano qua các điểm trình diễn của Sở Khoa học – Công nghệ và Trung tâm Khuyến nông thực hiện trên địa bàn các xã. Trước khi thả tôm giống, người nông dân dùng nano bạc kháng khuẩn pha đều tạt khắp ao, bình quân 2 lít/ 1000 m3, đồng thời tôm được 7 ngày nuôi thì dùng nano bạc trộn vào thức ăn cho tôm, cứ 2 ngày một lần, mỗi lần 150 ppm/kg thức ăn, từ ngày thứ 30 trở lên thì trộn 100 ppm/ kg thức ăn.
Kết quả nuôi tôm thẻ chân trắng tại trại nuôi tôm của Trường Đại học Nông lâm tp HCM sau 53 ngày cho thấy, tôm trong bể nuôi có sử dụng nano bạc còn sống trên 85% trong khi tôm nuôi trong bể không sử dụng nano bạc có tỷ lệ chết lên tới gần 100%. Hiện tại, công nghệ nano bạc đang được ứng dụng trên gần 6.000 m2 ao nuôi tôm tại Trang trại nuôi tôm công nghệ sạch Thái Tuấn (huyện Cần Giờ, tp HCM) và Trại tôm Hoàng Vũ (huyện Bình Đại – Bến Tre). Bước đầu, kết quả đánh giá nước trong ao qua xử lý nano bạc trong hơn, tôm khoẻ hơn tôm trong ao đối chứng.
Nhóm các nhà khoa học của Viện Khoa học Vật liệu, Viện Công nghệ môi trường thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Khoa Thuỷ sản, trường Đại học Nông lâm Huế đã nghiên cứu thành công và đưa ra thị trường tổ
hợp mang kháng sinh Ag-TiO4-Dox-Alginate, Ag-Fe3O4 -Dox-Alginate. Chế phẩm có khả năng xử lý môi trường nước, diệt khuẩn Vibrio gây các bệnh như phân trắng, gan tuỵ cấp, mòn đuôi, cụt râu ở tôm... (Nuôi tôm chân trắng bằng công nghệ nano (2018).
Nhóm nghiên cứu của Phòng Hoá học và vật liệu xúc tác, Viện Khoa học vật liệu, cũng đã thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ thường xuyên năm 2018 cấp cơ sở “Nghiên cứu chế tạo hệ nano Ag – chitosan ứng dụng khử trùng môi trường nuôi tôm thẻ chân trắng” dưới sự chủ trì của Thạc sỹ Trần Thị Hương. Nhóm nghiên cứu đã chế tạo hệ nano bạc – chitosan và sử dụng hệ nano này để xử lý nước nuôi tôm trong ao nuôi tôm thẻ chân trắng tại xã Quảng Nghiệp, huyện Tứ Kỳ, tỉnh Hải Dương. Kết quả cho thấy, nano Ag-chitosan ở nổng độ 0,003 ppm cho hiệu quả diệt vi sinh vật tổng số là 78,57% và đạt tiêu chuẩn yêu cầu của ngành thủy sản. Việc tăng hàm lượng nano làm tăng hiệu quả diệt khuẩn rõ rệt. Còn đối với khả năng diệt vi khuẩn Vibrio, kết quả cho thấy hàm lượng chỉ với 0,002 ppm nano Ag-chitosan vi khuẩn Vibrio đã bị tiêu diệt hoàn toàn.
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA DIỂM
Thời gian: từ 10/2019 – 8/2020. Địa điểm: Khoa Thuỷ sản - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Để đạt được các mục tiêu đề ra, đề tài thực hiện các nội dung theo sơ đồ mô tả (Hình 3.1) như sau:
Mẫu cá Nheo mỹ bị bệnh được phân lập, định danh vi khuẩn Aeromonas veronii bằng phương pháp PCR và được lưu trữ ở Bộ môn Môi trường và bệnh thuỷ sản
Nội dung 2
Thử nghiệm điều trị bệnh
do vi khuẩn Aeromonas
veronii quy mô phòng thí nghiệm Xác định độc lực và giá trị LD50 của vi khuẩn A. veronii Florphenicol và Nano bạc. 100 10-1 CFU/cá CFU/cá
3.3. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.3.1. Vi khuẩn sử dụng cho cảm nhiễm bệnh
Vi khuẩn Aeromonas veronii gốc được phân lập từ cá Nheo mỹ bị bệnh, được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm bộ môn Môi trường và bệnh thuỷ sản - Khoa Thủy Sản, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam. Vi khuẩn đã được định danh bằng phương pháp PCR và được nuôi tăng sinh trong môi trường NB (nutrient broth) từ 20 – 24 giờ, xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 610 nm kết hợp với phương pháp đếm số khuẩn lạc (CFU/ml) phát triển trên môi trường TSA để xác định mật độ vi khuẩn.
Hình 3.2. Vi khuẩn Aeromonas veronii dùng trong thí nghiệm 3.3.2. Cá thí nghiệm 3.3.2. Cá thí nghiệm
Cá Nheo mỹ được chọn làm thí nghiệm có trọng lượng 14,12 ± 0.3 g/con, màu sắc tươi sáng, phản ứng linh hoạt. Cá được bố trí ngẫu nhiên 10 con/bể thí nghiệm có kích thước 40 cm x 60 cm x 40cm và được nuôi thuần hoá trong 7 ngày. Trước khi gây cảm nhiễm, chọn ngẫu nhiên 10 con cá kiểm để tra ký sinh trùng và phân lập vi khuẩn từ thận để xác định cá không nhiễm ký sinh trùng và vi khuẩn.
3.3.3. Thuốc thí nghiệm
- Kháng sinh Florphenicol nguyên liệu có nguồn gốc từ công ty VMC Việt Nam cung cấp và sử dụng tại phòng thí nghiệm bộ môn Môi trường và bệnh thuỷ sản. Kháng sinh đã được định lượng và xác định hàm lượng bằng hệ thống HPLC trước khi sử dụng trong thí nghiệm.
- Nano bạc 10.000 ppm có nguồn gốc từ công ty CO-ACTION CORP.
Hình 3.3. Nano bạc dùng trong thí nghiệm
- Thuốc được trộn trực tiếp vào thức ăn và cho cá ăn.
3.3.4. Hoá chất và thiết bị
-Thuốc nhuộm Gram
- Dung môi hoà tan kháng sinh: M-methyl-2-pyrrolidone và polyethylene glycol.
- Các loại máy móc thiết bị dùng trong đề tài thuộc phòng thí nghiệm Bộ môn Môi trường và bệnh thuỷ sản – Khoa Thuỷ sản – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Cân phân tích, kính hiển vi, nồi hấp, máy Vortex, tủ ấm, tủ cấy vô trùng, tủ sấy vô trùng, đĩa petri, que cấy trang, đèn cồn, cốc đong thuỷ tinh, lam kính, bộ giải phẫu: dao, kéo, panh.
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Tính nhạy của vi khuẩn Aeromonas veronii với kháng sinh Florphenicol và Nano bạc và Nano bạc
Mục đích: Xác định được khả năng kháng khuẩn của kháng sinh và Nano bạc đối với vi khuẩn A. veronii.
Nguyên lý: Phương pháp kháng sinh đồ dựa trên sự khuếch tán của kháng sinh trên thạch đĩa của Kirby-Bauer (Bauer & cs., 1966), dựa trên đường kính vòng vô khuẩn theo tiêu chuẩn của Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (2007). Các bước tiến hành:
1, Thí nghiệm gồm 5 công thức (CT), mỗi CT được bố trí lặp lại ba lần, liều lượng sử dụng như sau: Công thức thí nghiệm CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 (Đối chứng)
2, Vi khuẩn gốc được phân lập từ cá nhiễm bệnh do Aeromonas veronii và lưu trữ tại bộ môn Môi trường và bệnh thuỷ sản – Khoa Thuỷ sản Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Sau đó được nuôi tăng sinh trong môi trường Nutrient Broth (NB) trong 20-24 giờ ở nhiệt độ 28 – 300C.
3, Đĩa thạch TSA được chuẩn bị trước cấy 100 µl vi khuẩn A.veronii trên có mật độ 0.26 x 109 cfu/mL, trang đều cho khô.
4, Đặt lên mỗi đĩa 2 khoanh giấy có độ dày 0,5 mm, đường kính 4mm đã được vô trùng sao cho mặt khoanh giấy áp sát vào mặt môi trường.
5, Nhỏ lượng kháng sinh và Nano bạc 10 µl/một đĩa giấy đối với từng công thức thí nghiệm.
6, Để đĩa thạch trong tủ ấm 300C. Vòng vô khuẩn được quan sát và đo sau 24h. 3.4.2. Điều trị bệnh do vi khuẩn Aeromonas veronii trong phòng thí nghiệm Thời gian thí nghiệm: từ 09/07 – 31/07/2020
Mục đích: Kiểm chứng xem khi kết hợp kháng sinh với Nano bạc có thể điều trị được bệnh do vi khuẩn A. veronii gây ra trên cá Nheo mỹ.
Nguyên lý: Từ kết quả tính nhạy giữa kháng sinh và Nano bạc trong phòng thí nghiệm, bố trí thí nghiệm để kiểm chứng với cá bị cảm nhiễm không được điều