Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.6.4.Phương pháp Realtime PCR
3.6. Phương pháp nghiên cứu
3.6.4.Phương pháp Realtime PCR
+ Tách chiết DNA.
DNA được tách chiết bằng kit TacoTM DNA/RNA Extraction Kit để tiến hành phản ứng Realtime PCR.
Các bước tách chiết DNA được thực hiện theo hướng dẫn đi kèm của nhà sản xuất gồm:
• Thêm thuốc thử vào đĩa ly trích 96 giếng/48 giếng theo bảng dưới đây ở nhiệt độ phòng (16 – 30oC).
Bảng 3.1. Thuốc thử
Bước Thuốc thử
1 Thêm 200µl cồn 95% và 500µl dung dịch đệm giải vào cột 1 (cột 7)
2 Thêm 750µl dung dịch đệm rửa A1 vào cột 2 (cột 8)
3 Thêm 750µl dung dịch đệm rửa A vào cột 3 (cột 9)
4 Thêm 750µl dung dịch đệm rửa B2 vào cột 4 (cột 10)
5 Thêm 750µl dung dịch đệm rửa B vào cột 5 (cột 11)
6 Thêm 50 – 200µl dung dịch đệm rửa giải vào cột 6 (cột 12)
7 Thêm 50µl hạt từ tính (3) vào cột 2 (cột 8)
1 Đảm bảo rằng 135 ml cồn 95% đã được thêm vào dung dịch đệm rửa A trước khi sử dụng lần đầu tiên.
2 Đảm bảo rằng 230 ml cồn 95% đã được thêm vào dung dịch đệm rửa B trước khi sử dụng lần đầu tiên.
• Hút 200µl dung dịch mẫu đồng nhất vào cột 1 (cột 7) của đĩa ly trích 96 giếng/48 giếng. Mở cửa máy TacoTM để lắp đĩa ly trích và lược vào, đảm bảo rằng chúng được đặt vào đúng vị trí.
• Đóng cửa máy TacoTM và nhấn nút “Start” để bắt đầu tách chiết. Máy sẽ tách xong sau 50 phút. Sau khi tách chiết xong, lấy đĩa ly trích và lược ra, sau đó nhấn nút “Reset” để thiết lập lại chương trình.
• Thu acid Nucleic từ cột 6 hoặc cột 12, cho vào ống 1,5 ml mới để sử dụng.
• Acid Nucleic tách chiết nên được bảo quản lạnh, nếu để lưu trữ lâu dài thì nên bảo quản ở -80oC.
3
Than hoạt tính phải được giữa kín trước khi sử dụng
Huyễn dịch bệnh phẩm sau khi được thực hiện tách chiết DNA bằng các kít thương mại và bảo quản mẫu DNA ở 40C nếu xét nghiệm ngay, hoặc bảo quản - 200C trong thời gian dài.
Chuẩn bị mồi
Phản ứng Realtime PCR sử dụng cặp mồi xuôi, mồi ngược và đoạn dò được thiết kế dựa trên vùng ổn định của gen P72 như sau:
Stt Tên
1 Mồi xuôi ASFV
2 Đoạn dò ASFVCCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG (0,3µM)
3 Mồi ngược ASFVTCTCTTGCTCTRGATACRTTAATATGA (0,9µM)
Tiến hành phản ứng Realtime PCR
Sử dụng cặp mồi đã chuẩn bị và bộ kít thương mại, pha hỗn hợp phản ứng (Master mix) và cài đặt chu trình nhiệt theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phòng thí nghiệm sử dụng kit để chẩn đoán là: invitrogen – Super scrip iiI®platium one – Step qRT – PCR System.
Thành phần Master mix như trong bảng 3.3.
Sau khi chuẩn bị xong nguyên liệu master mix tiến hành:
• Thêm 2µl DNa của mẫu vừa tách chiết vào ống và spin down.
• Đối với ống đối chứng dương và âm cũng cho tương tự 13µl hỗn hợp Master mix vào ống Real – time PCR 0,2ml. Sau đó thêm:
• Thêm 2µl Dna dương chuẩn của virus DTLCP có giá trị Ct đã biết trước vào ống đối chứng dương.
• Cho 2µl nước tinh khiết không có Rna và DnA vào ống đối chứng âm.
Chú ý: Phản ứng Realtime PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương (Postive – POS) và mẫu đối chứng âm (negative – nEg).
Bảng 3.3. Thành phần phản ứng Realtime PCR
STT Thành phần nguyên liệu
1 DW
2 2x Reaction buffer
3 Mồi xuôi ASFV
4 Mồi ngược ASFV
5 Đầu dò ASFV
6 Enzym mix
Tổng thể tích dung dịch đệm cho 1 phản ứng
7 Mẫu tách chiết DNA
Tổng thể tích cho 1 phản ứng
Cài đặt chu kỳ luân nhiệt và chạy phản ứng Realtime – PCR
Sau khi Master mix, đặt ống vào máy Realtime PCR để chạy phản ứng theo chu kỳ luân nhiệt sau:
Bảng 3.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng Realtime PCR
Nhiệt độ
95oC 95oC 60oC
Kết quả của phản ứng Realtime PCR được xác định dựa vào chu kỳ ngưỡng (Cycle threshold: Ct).
Phản ứng được công nhận khi mẫu đối chứng dương tính (được chẩn độ trước) phải có giá trị Ct tương đương giá trị Ct đã biết (± 2Ct), mẫu đối chứng âm không có Ct.
Với điều kiện phản ứng:
•Mẫu dương tính khi giá trị Ct ≤ 35;
•Mẫu ấm tính khi không có giá trị Ct;
•Mẫu nghi ngờ khi giá trị Ct >35.
Đánh giá kết quả: mẫu có virus DTLCP khi kết quả Realtime PCR dương tính. Với những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm khác để khẳng định kết quả.