Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.6.5.Phương pháp RT-PCR
3.6. Phương pháp nghiên cứu
3.6.5.Phương pháp RT-PCR
3.6.5.1. Phương pháp tách chiết DNA/RNA tổng số
Tách chiết DNA/RNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm sử dụng Kit chiết tách thương mại. Các bước tách chiết DNA/RNA được thực hiện theo hướng dẫn đi kèm của nhà sản xuất gồm:
1. Lấy 560 µl dung dịch AVL có chứa carrier RNA cho vào ống ly tâm
1.5 ml;
2. Thêm 140 µl mẫu (huyết tương, huyết thanh, dịch nuôi cấy tế bào, dịch swab) vào ống ly tâm trên. Trộn đều bằng máy voltex;
3. Ủ ở nhiệt độ 15-200C trong 10 phút;
4. Ly tâm để cho các phần dung dịch trên nắp rơi xuống hết ống nghiệm;
5. Thêm 560 µl ethanol (96-100%) vào mẫu, trộn đều bằng máy voltex trong
15giây. Sau đó, spindown toàn bộ dung dịch xuống;
6. Cẩn thận lấy 630 µl dung dịch ở bước 5 cho vào ống Qiaamp Mini (dung tích 2ml). Đậy nắp, ly tâm tốc độ 8000 vòng/phút/1 phút, loại bỏ phần dịch phía dưới;
7. Lặp lại bước 6;
8. Cho 500µl buffer AW1. Đậy nắp, ly tâm tốc độ 8000 vòng/phút/1 phút. Loại bỏ dịch dưới ống;
10. Ly tâm tốc độ 1400 vòng/phút/ 3 phút. Thu được 60 µl dịch chiết ARN
tổng số;
11. Bảo quản mẫu RNA ở nhiệt độ -200C.
3.6.5.2. Phương pháp RT- PCR
Các bước tiến hành phản ứng RT – PCR: Mẫu RNA tổng số sau khi tách chiết sẽ được trộn với các thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Thành phần phản ứng RT-PCRThành phần phản ứng Thành phần phản ứng 2X Reaction Mix Mẫu RNA Mồi xuôi (10µM) Mồi ngược (10µM) RT/Platium Taq Nước cất Tổng số
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt với cặp mồi:
PRRSVF: 5’-TCC TAC Tgg CAA TTT GAA TG-3’; PRRSVR: 5’-CCT TTA GAG CAT ATA TCA TCA C-3’; CSF4F: 5’-CCT GAG GAC CAA ACA CAT GTT G-3’; CSF5R: 5’-TGG TGG AAG TTG GTT GTG TCT G-3’.
Chu kỳ của phản ứng nhiệt RT-PCR cho PRRSV
Giai đoạn Bước tổng hợp
1 Tổng hợp cDNA Duỗi mạch 2 Duỗi mạch Gắn mồi Tổng hợp sợi mới 3 hoàn chỉnh 4 Giữ sản phẩm
Chu kỳ của phản ứng nhiệt RT-PCR cho CSFV
Giai đoạn Bước tổng hợp
1 Tổng hợp cDNA Duỗi mạch 2 Duỗi mạch Gắn mồi Tổng hợp sợi mới 3 hoàn chỉnh 4 Giữ sản phẩm
Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Dung dịch đệm thường được sử dụng trong điện di agarose và polyacrylamid là TBE, trong nghiên cứu này sử dụng TBE và agarose để tạo bản gel.
Chuẩn bị gel: hòa tan 1,2 gam agarose với 100ml dung dịch đệm TBE 1X, đun nóng ở 1000C/5 phút. Sau đó đổ vào khuôn có lược được cài sẵn để tạo bản gel với các giếng tra mẫu điện di. Khi bản gel đã đông cứng đặt bản gel vào bể điện di và bổ sung dung dịch đệm TBE ngập bản gel khoảng 3 – 5 mm.
•Bước 2: Tra mẫu điện di
Thêm 2 µl loading dye vào 8 µl sản phẩm RT- PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản thạch. Điện di đồng thời cả thang chuẩn DNA (marker), thường sử dụng 4-6 µl DNA Marker.
•Bước 3: Chạy điện di
Nguồn điện trong điện di thường sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút.
•Bước 4: Nhuộm bản gel và đọc kết quả
Kết thúc điện di, bản gel được chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết quả điện di. Vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng những vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và lưu kết quả.