Bảng 3.5. Thành phần phản ứng RT-PCRThành phần phản ứng Thành phần phản ứng 2X Reaction Mix Mẫu RNA Mồi xuôi (10µM) Mồi ngược (10µM) RT/Platium Taq Nước cất Tổng số
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt với cặp mồi:
PRRSVF: 5’-TCC TAC Tgg CAA TTT GAA TG-3’; PRRSVR: 5’-CCT TTA GAG CAT ATA TCA TCA C-3’; CSF4F: 5’-CCT GAG GAC CAA ACA CAT GTT G-3’; CSF5R: 5’-TGG TGG AAG TTG GTT GTG TCT G-3’.
Chu kỳ của phản ứng nhiệt RT-PCR cho PRRSV
Giai đoạn Bước tổng hợp
1 Tổng hợp cDNA Duỗi mạch 2 Duỗi mạch Gắn mồi Tổng hợp sợi mới 3 hoàn chỉnh 4 Giữ sản phẩm
Chu kỳ của phản ứng nhiệt RT-PCR cho CSFV
Giai đoạn Bước tổng hợp
1 Tổng hợp cDNA Duỗi mạch 2 Duỗi mạch Gắn mồi Tổng hợp sợi mới 3 hoàn chỉnh 4 Giữ sản phẩm
Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Dung dịch đệm thường được sử dụng trong điện di agarose và polyacrylamid là TBE, trong nghiên cứu này sử dụng TBE và agarose để tạo bản gel.
Chuẩn bị gel: hòa tan 1,2 gam agarose với 100ml dung dịch đệm TBE 1X, đun nóng ở 1000C/5 phút. Sau đó đổ vào khuôn có lược được cài sẵn để tạo bản gel với các giếng tra mẫu điện di. Khi bản gel đã đông cứng đặt bản gel vào bể điện di và bổ sung dung dịch đệm TBE ngập bản gel khoảng 3 – 5 mm.
•Bước 2: Tra mẫu điện di
Thêm 2 µl loading dye vào 8 µl sản phẩm RT- PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản thạch. Điện di đồng thời cả thang chuẩn DNA (marker), thường sử dụng 4-6 µl DNA Marker.
•Bước 3: Chạy điện di
Nguồn điện trong điện di thường sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút.
•Bước 4: Nhuộm bản gel và đọc kết quả
Kết thúc điện di, bản gel được chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết quả điện di. Vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng những vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và lưu kết quả.
3.6.6. Phương pháp PCR
3.6.6.1 Tiến hành chạy PCR
Mẫu DNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần được trình bày ở bảng 3.6.