Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.6.8.Phương pháp làm tiêu bản vi thể
3.6. Phương pháp nghiên cứu
3.6.8.Phương pháp làm tiêu bản vi thể
Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến đổi đại thể được lấy mẫu ngâm trong formol trung tính 10% để làm tiêu bản vi thể. Cần tiến hành làm tiêu bản để xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh. Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm đúc bằng parafin, nhuộm Haematoxilin - Eosin (HE) tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y. Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:
3.6.8.1. Cố định mẫu
- Mẫu bệnh phẩm sau khi mổ khám được ngâm ngập trong formol 10%, Sau 24 giờ thay formol mới với thể tích gấp 10-20 lần thể tích bệnh phẩm.
- Sau khi bản quản trong formol 10% từ 5-7 ngày, kiểm tra tổ chức đã chín thì tiến hành lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành các miếng nhỏ theo kích thước 1cm x 0.5cm x 0,3cm, cố định trong casset block rồi tiếp tục cho ngâm ngập trong dung dịch formol 10%. Mẫu mô làm hóa mô miễn dịch cố định trong formol tối thiểu 1 tuần và tối đa 2 tuần thì chuyển đúc vào parafin (yêu cầu thể tích dung dịch cố định gấp ít nhất 10 lần thể tích bệnh phẩm).
3.6.8.2. Chuyển đúc
a. Rửa formol
Đem rửa nước chảy nhẹ 1 giờ, để rửa sạch hết formol.
b. Khử nước Cho qua hệ thống cồn: + Cồn 700 1: 15 phút + Cồn 700 2: 2 giờ + Cồn 800: 2 giờ + Cồn 900: 2 giờ + Cồn 1000: 2 giờ + Cồn 1000: Qua đêm c. Khử cồn
Cho qua hệ thống 3 lọ xylen:
+ Xylen 1: 1,5 giờ
+ Xylen 2: 1,5 giờ
+ Xylen 3: 1,5 giờ d. Khử xylen - tẩm paraffin
Cho mẫu vào paraffin nóng chảy
+ Paraffin 1: 1,5 giờ
e. Đúc block
+ Chuẩn bị: máy đúc block, khuôn block, paraffin sạch nóng chảy ở 580C
+ Tiến hành:
- Đặt miếng bệnh phẩm vào ngăn chứa paraffin lỏng
- Đổ paraffin lỏng vào khuôn, dùng kẹp hơ nóng nhúng nhanh vào ngăn chứa bệnh phẩm, gắp miếng bệnh phẩm đặt vào khuôn. Đặt vào chính giữa, để vào chính giữa, để miếng bệnh phẩm nằm theo ý muốn.
- Đặt khuôn đã đúc sang bàn lạnh của máy làm nguội block. Để nguội từ từ đến khi đông cứng, đặc chắc là được.
3.6.8.3. Cắt và dán mảnh
- Cắt bằng máy microtocom với độ dày 3 µm, sao cho mảnh cắt không rách nát phần tổ chức là được.
- Tãi và dán mảnh qua bình nước lạnh (nước cất 2 lần ở nhiệt độ phòng) và bình nước ấm (450C). Khi thấy mảnh cắt duỗi ra hoàn toàn phẳng, không bị nhăn, rách, không có vết xước của dao cắt có thể dùng phiến kính vớt lên, để cho nghiêng hết nước rồi đặt lên máy phiến nhiệt để làm khô tiêu bản (ít nhất 2 giờ) là có thể đem nhuộm được.
Nhuộm tiêu bản gồm các bước:
+Khử parafin: cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ: Xylen i: 6h
Xylen ii: 6h Xylen III: 12h
+ Khử xylen: cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ: Cồn 1000: 2lần (mỗi lần 1 phút)
Cồn 950: 1 lần Cồn 700: 1 lần Cồn 500: 1 lần
+ Khử cồn: cho dưới vòi nước chảy 15 phút.
Khi nhấc tiêu bản ra khỏi nước lau khô xung quanh tiêu bản, nhỏ haematoxylin ngập tiêu bản. Để trong khoảng hơn 5 phút sau đó đổ thuốc nhuộm đi, rửa qua nước. Đem lau sạch nước xung quanh tiêu bản và vẩy khô đi. Kiểm tra màu sắc, nếu thấy tiêu bản xanh tím là được.
Nếu nhạt màu thì nhúng tiêu bản qua NaHcO3 1% (30 giây). Nếu đậm quá thì nhúng tiêu bản vào lọ cồn axit (cồn 960 + Hcl 1%) trong 30 giây.
Sau khi điều chỉnh màu ta rửa sạch tiêu bản bằng nước cất. Sau đó cho tiêu bản qua hệ thống cồn:
Cồn 500: 1 lần Cồn 700: 1 lần Cồn 950: 1 lần Cồn 1000: 2 lần Rửa tiêu bản bằng nước cất.
+ Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 5-10 phút tuỳ theo thực tế màu Eosin. Sau đó rửa nước chảy 15 phút cho hết Eosin thừa bám trên phiến kính.
Cho tiêu bản qua hai lọ cồn 1000 mỗi lọ 1 phút.
+ Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: cho tiêu bản đi qua hai lọ xylen mỗi lọ 3 phút.
- Gắn Baume canada:
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản. Ấn nhẹ để dồn hết bọt khí ra ngoài.
- Đánh giá kết quả:
Đem soi lên kính hiển vi quang học vật kính 10. Nếu thấy nhân bắt màu xanh tím, bào tương bắt màu đỏ tươi, tiêu bản trong sáng, không có nước, không có bọt khí là được.