Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.4. Kết quả thiết kế chỉ thị xác định gen Pi21 có khả năng kháng đạo ôn
OM6377, Tép Thái Bình, Khẩu Liến, Tám xoan Bắc Ninh, Nàng quớt biển đều mang trình tự gen tương đồng so với trình tự gen tham chiếu. Bốn giống Nếp mặn, Tốc lùn, Khấu mặc buộc, Nếp mèo nương đều chứa đoạn trình tự thiếu 17 nucletide với gen Pit và thiếu 24 nucleotide với gen Pi21 so với từng trình tự gen tham chiếu.
4.4. KẾT QUẢ THIẾT KẾ CHỈ THỊ XÁC ĐỊNH GEN PI21 CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG ĐẠO ÔN KHÁNG ĐẠO ÔN
Kết quả tầm sốt và so sánh trình tự locus gen Pi21 của 17 giống lúa bản địa với gen kháng đạo ôn bằng các phần mềm chuyên dụng cho thấy: tần số xuất hiện các đa hình đơn nucleotide (SNP) và các đoạn thêm, bớt (InDels) giữa các giống khá cao. Đặc biệt, có đoạn trình tự được chèn vào với 24 nucleotide đối với 9 giống lúa bản địa của Việt Nam giống như gen tham chiếu đã được công bố, đó là: Khẩu Liến, Tám xoan Bắc Ninh, Ble te lo, OM6377, Tép Thái Bình, Nàng quớt biển, Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2, Nếp lùn, Lúa gốc đỏ (Hình 4.8).
Bảng 4.4. Bảng thống kê số lượng amino acid của các gen ứng viên Pi21 ở các giống lúa đã giải trình tự
Tên giống/ gen
tham chiếu Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gln Arg Ser Thr Val Trp Tyr Tổng
LOC Os04g32850(Pi21) 7 34 7 22 2 12 5 12 34 9 2 5 73 4 5 4 1 15 6 7 266 Khẩu Liến 7 34 7 22 2 12 5 12 34 9 2 5 73 4 5 4 1 15 6 7 266 Tám xoan Bắc Ninh 7 34 7 22 2 12 5 12 34 9 2 5 73 4 5 4 1 15 6 7 266 Ble te lo 7 34 7 22 2 12 5 12 34 9 2 5 73 4 5 4 1 15 6 7 266 OM6377 7 34 7 22 2 12 5 12 34 8 2 5 73 4 5 5 1 15 6 7 266 Tép Thái Bình 7 34 7 22 2 12 5 12 34 8 2 5 73 4 5 5 1 15 6 7 266 Nàng quớt biển 7 34 7 22 2 12 5 12 34 8 2 5 73 4 5 5 1 15 6 7 266 Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2 7 34 7 22 2 12 5 12 34 8 2 5 73 4 5 5 1 15 6 7 266 Nếp lùn 7 34 7 22 2 12 5 12 34 8 2 5 73 4 5 5 1 15 6 7 266 Lúa gốc đỏ 7 34 7 22 2 12 5 12 34 8 2 5 73 4 5 5 1 15 6 7 266
Khấu điển lư 7 33 7 22 2 12 5 12 34 8 2 5 67 3 5 4 1 15 6 7 257
Tám xoan Hải Hậu 7 33 7 22 2 12 5 12 34 8 2 5 67 3 5 4 1 15 6 7 257
Hom râu 7 33 7 22 2 12 5 12 34 8 2 5 67 3 5 4 1 15 6 7 257 Khấu mặc buộc 7 33 7 22 2 12 5 12 34 8 2 5 67 3 5 4 1 15 6 7 257 Nếp mèo nương 7 33 7 22 2 12 5 12 34 8 2 5 67 3 5 4 1 15 6 7 257 Thơm Lài 7 33 7 22 2 12 5 12 34 7 2 5 67 3 5 5 1 15 6 7 257 Nếp mặn 7 33 7 22 2 12 5 12 34 7 2 5 67 3 5 5 1 15 6 7 257 Tốc lùn 7 33 7 22 2 12 5 12 34 7 2 5 67 3 5 5 1 15 6 7 257 download by : skknchat@gmail.com
Dựa vào sự sai khác về trình tự đoạn gen giữa 17 giống lúa bản địa ở vị trí chèn thêm 24 nucleotide đặt ra việc thiết kế cặp mồi nhân đặc hiệu mà có thể nhân lên đoạn gen tương đồng ở 17 giống lúa bản địa chứa vị trí chèn thêm 24 nucleotide ở 9 giống lúa bản địa: Khẩu Liến, Tám xoan Bắc Ninh, Ble te lo, OM6377, Tép Thái Bình, Nàng quớt biển, Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2, Nếp lùn, Lúa gốc đỏ và khơng chứa vị trí chèn thêm 24 nucleotide ở 8 giống lúa bản địa: Khấu điển lư, Tám xoan Hải Hậu, Hom râu, Khấu mặc buộc, Nếp mèo nương, Thơm Lài, Nếp mặn, Tốc lùn. Độ dài mồi nên nằm trong khoảng 18-24 nucleotide. Độ dài này đủ dài để đảm bảo tính đặc hiệu và đủ ngắn để mồi gắn đễ dàng vào khuôn.
Sử dụng phần mềm MEGA 6.0 tiến hành tìm kiếm đánh giá đoạn ADN 18-24 nucleotide ở phần trước và sau vị trí chèn thêm 24 nucleotide sao cho đoạn ADN này giữa 17 giống lúa địa phương khơng có sự sai khác để khi PCR cặp mồi sẽ bắt cặp tại cùng một vị trí trên trình tự gen ở 17 giống lúa bản địa của Việt Nam từ đó ta có thể phân biệt được 9 giống lúa có vị trí chèn thêm 24 nucleotide và 8 giống lúa khơng có vị trí chèn thêm 24 nucleotide (Hình 4.10). Để dễ dàng phân biệt trên băng điện di, chiều dài đoạn ADN nhân lên giữa 2 mồi nên nằm trong khoảng 350-400 nucleotide để có thể nhận biết được sự sai khác 24 nucelotide.
Phần mềm Vector NTI Advance 11.0 là một phần mềm đa chức năng như: phân tích trình tự đã lựa chọn và thiết kế mồi PCR cho trình tự đó, dựa trên các thơng số như nhiệt độ nóng chảy, %GC và chiều dài đoạn khuếch đại; phân tích phân tử ADN/ARN và xác định khung đọc mở (ORFs); phân tích phân tử ADN/ARN và xác định các vị trí giới hạn trên phân tử đó; sắp xếp thành hàng các trình tự của hai hoặc nhiều phân tử ADN/ARN; sử dụng để lắp ghép các đoạn ADN (cả các trình tự nguyên bản và sắc phổ) thành trình tự tiếp giáp dài hơn.
Hình 4.9. Ảnh thiết kế mồi nhân đoạn ADN có chứa vùng chèn thêm 24 nucleotide thông qua phần mềm Vetor NTI 11.0
Để kiểm tra tính đặc hiệu của cặp mồi trên 17 giống lúa bản địa của Việt Nam, tiến hành đối chiếu cặp mồi thu được từ phần mềm Vector NTI Advance 11.0 trên phần mềm MEGA 6.0. Kết quả (Hình 4.10) cho thấy hai mồi đều bắt cặp đặc hiệu với cùng 1 vị trí trên đoạn trình tự ADN tương đồng so với gen Pi21 tham chiếu đã cơng bố.
Để kiểm tra tính đặc hiệu của cặp mồi trên tồn bộ trình tự bộ gen của lúa đã công cố trên cơ sở dữ liệu NCBI, tiến hành đối chiếu cặp mồi thu được từ phần mềm Vector NTI Advance 11.0 trên phần mềm BLAST. Kết quả (Hình 4.11, Hình 4.12) cho thấy hai mồi đều bắt cặp đặc hiệu với vị trí trong gen Pi21 trong trình tự hệ gen của lúa đã cơng bố.
Hình 4.10. Kiểm tra sự bắt cặp của cặp mồi Pi21 ở vùng CDS trên 17 giống lúa
Trong nghiên cứu này nhờ có sự khác biệt của gen Pi21 giữa các giống lúa đã giải trình tự mà đã phát triển được chỉ thị SSLP dựa vào sự thêm/bớt ADN của các alen Pi21 với chỉ thị thiết kế có tên Pi21 (Pi21F: GACCCGGAGAA
GCTGTGCAAGA / Pi21R: CTTTGGGCAGCACCACTGCC) (Hình 4.9). Theo
tính tốn thiết kế và so sánh với gen tham chiếu của thế giới đã công bố, cặp mồi
Pi21 sẽ nhân lên băng kích thước 393 bp (ở các giống mang gen Pi21 giống với
trình tự thế giới cơng bố) và băng 369 bp (ở các giống mang gen Pi21 khác với trình tự gen Pi21 thế giới cơng bố).
Hình 4.11. Kết quả BLAST với mồi Pi21F: GACCCGGAG AAGCTGTGC AAGA
Hình 4.12. Kết quả BLAST với mồi Pi21R: CTTTGGGCAGCACCACTGCC
Dựa vào kết quả kiểm tra bằng phần mềm MEGA 6.0 và BLAST cho thấy cặp mồi Pi21 là đặc hiệu cho gen kháng đạo ôn Pi21 và sẽ nhân lên băng kích
thước 393 bp (ở các giống mang gen Pi21 giống với trình tự thế giới công bố) và băng 369 bp (ở các giống mang gen Pi21 khác với trình tự gen Pi21 thế giới cơng bố (Hình 4.10, Hình 4.11, Hình 4.12).
Hình 4.13. Ảnh điện di sản phẩm PCR đối với cặp mồi Pi21 nhận biết gen
Pi21 ở các giống lúa bản địa của Việt Nam (thứ tự các mẫu theo bảng 3.1)
Theo thiết kế mồi và so sánh với gen tham chiếu của thế giới đã cơng bố thì khi thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi Pi21 có các khả năng sau xảy ra: nếu có sự xuất hiện của băng kích thước 393 bp, nghĩa là các giống này mang gen Pi21 có vùng CDS có số lượng giống với gen Pi21 đã được cơng bố; nếu có sự xuất
hiện của băng kích thước khác 369 bp nghĩa là các giống này có vùng CDS khác với gen Pit kháng đạo ôn đã công bố.
Sử dụng cặp mồi thiết kế Pi21 để kiểm tra sự đa hình của locus gen kháng
Pi21 với 17 giống lúa trong tập đồn lúa bản địa (Hình 4.13). Kết quả thu nhận
được thơng qua các số liệu và hình ảnh cho thấy 9/17 giống lúa bản địa là Khẩu Liến, Tám xoan Bắc Ninh, Ble te lo, OM6377, Tép Thái Bình, Nàng quớt biển, Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2, Nếp lùn, Lúa gốc đỏ đã giải trình tự có sự xuất hiện của băng kích thước 393 bp, đây là 9 giống có đoạn chèn thêm 24 nu và chiều dài bằng gen tham chiếu.
Tám giống còn lại: Khấu điển lư, Tám xoan Hải Hậu, Hom râu, Khấu mặc buộc, Nếp mèo nương, Thơm Lài, Nếp mặn, Tốc lùn xuất hiện băng với kích thước 369 bp, là các giống khơng có đoạn chèn thêm 24 nucleotide.
Kết quả điện di trùng khớp với kết quả phân tích đối chiếu 17 đoạn trình tự gen tương đồng với trình tự gen Pi21 tham chiếu. Như vậy, cặp mồi này có thể
xác định được sự đa hình của gen Pi21 và có thể sử dụng để xác định sự có mặt của các gen này ở bố, mẹ và các thế hệ con lai phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa có khả năng kháng đạo ơn.