Phần 2 Tổng quan tài liệu
2.7. Chỉ thị ADN trong xác định gen liên quan đến kháng đạo ôn
ĐẠO ÔN
2.7.1. Chỉ thị ADN
Chỉ thị phân tử (chỉ thị ADN) là các chỉ thị chọn lọc trực tiếp dựa trên cấu trúc phân tử ADN. Số lượng các chỉ thị ADN là rất lớn, cây trồng có khoảng 108 - 1010 nucleotide trong ADN tổng số và vì thế, nếu giữa 2 cá thể chỉ cần có sự sai khác nhỏ thì giữa chúng sẽ có một số lượng khổng lồ các chỉ thị ADN để
phân biệt sự sai khác đó. Theo lý thuyết, một chỉ thị ADN lý tưởng phải đáp ứng đầy đủ các yêu cầu sau:
- Cho đa hình cao - Di truyền đồng trội
- Xuất hiện nhiều trong genome - Tập tính chọn lọc trung tính - Dễ tiếp cận
- Phân tích nhanh, dễ dàng
Tuy nhiên, gần như khơng thể tìm được một chỉ thị phân tử nào có thể thoả mãn được tất cả các yêu cầu trên. Tuỳ thuộc vào từng nghiên cứu mà người ta sử dụng hệ thống các chỉ thị phù hợp cho mục đích của mình. Các chỉ thị phân tử được phân loại dựa trên phương pháp thực hiện với chúng bao gồm: chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN (chỉ thị RFLP) và chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản ADN (chỉ thị RFLP, RADP, SSR…).
2.7.2. Phương pháp thiết kế chỉ thị phân tử
Mồi là một chuỗi oligonucleotide sợi đơn ngắn (kích thước thường từ 18 – 24 nucleotide). Có hai loại mồi được sử dụng cho chẩn đốn bệnh cây:
Mồi chung (universal/degenerate primers): được thiết kế trên các vùng bảo thủ cao, có khả năng phát hiện các đối tượng khác hẳn nhau (thường các đối tượng của một chi, một họ).
Mồi đặc hiệu (specific primers): được thiết kế trên các vùng có thể phân biệt được lồi, thậm chí dưới lồi như chủng/nịi/type sinh học…
Có được các mồi tốt là bước quan trọng nhất trong chẩn đốn bệnh cây. Có 2 cách để có thể nhận được các mồi tốt :
-Tham khảo và lựa chọn từ các nghiên cứu đã được công bố. -Tự thiết kế mồi.
Để tự thiết kế mồi dựa trên các chuỗi gen sẵn có trên Genbank, người ta cần sử dụng một phần mềm có khả năng căn trình tự đa chuỗi (multiple sequence alignment), chẳng hạn ClustalX, Bioedit, MEGA 6.0. Ngay sau khi các chuỗi ADN đã được căn trình tự, chúng ta có thể thiết kế các mồi chung hay mồi đặc hiệu tùy theo yêu cầu.
Các chú ý khi thiết kế mồi:
-Độ dài mồi: Nên nằm trong khoảng 18-24 nucleotide. Độ dài này đủ dài để đảm bảo tính đặc hiệu và đủ ngắn để mồi gắn đễ dàng vào khuôn.
-Nhiệt độ tách chuỗi (Tm = Melting Temperature): Tm là nhiệt độ mà tại đó 1/2 số sợi ADN kép tách thành sợi đơn. Tm của mồi nên nằm trong khoảng 52-600C.
-Nhiệt độ gắn mồi (Ta = annealing temperature): Ta được tính dựa trên Tm. Ta quá cao làm mồi khó gắn vào khn dẫn tới năng xuất PCR thấp. Ta quá thấp làm mồi dễ gắn không đặc hiệu vào khuôn dẫn tới tạo các sản phẩm không đặc hiệu. Ta của 2 mồi xi và ngược dịng nên tương đương. Có nhiều cách tính Ta:
Ta = 0.3 x Tm(mồi) + 0.7 Tm (sản phẩm) – 14.9
-Hàm lượng GC: Số các gốc G và C nên nằm trong khoảng 40-60%.
-Chuỗi GC đầu 3’: Đầu tận cùng 3’ nên là G hoặc C hoặc GC hoặc CG. Đầu 3’ khơng nên có nhiều hơn 3 gốc liên tục G/C.
-Việc lựa chọn chiều dài mồi và nhiệt độ nóng chảy của chúng dựa vào một số lý do. Nhiệt độ nóng chảy của mồi được định nghĩa là nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ của mồi mà sẽ anneal khuôn ADN và cao hơn nhiệt độ làm mồi rời khỏi khuôn ADN. Nhiệt độ nóng chảy cần tăng lên theo độ dài của mồi. Mồi quá ngắn sẽ làm anneal một số vị trí trên khn ADN dài, dẫn đến các bản sao khơng đặc hiệu. Nói cách khác, chiều dài của mồi bị giới hạn bởi nhiệt độ làm nóng chảy nó. Nhiệt độ nóng chảy quá cao, nghĩa là trên 80°C, có thể gây ra một số vấn đề do ADN polymerase ít hoạt động ở nhiệt độ này. Chiều dài tối ưu của mồi vào khoảng 30 đến 40 nucleotide với nhiệt độ nóng chảy vào khoảng 60°C đến 75°C. Có một số cách để tính nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi. (A, G, C và T tương ứng là số nucleotide của mồi. [Na+] là nồng độ Na+ trong PCR)
Các chuỗi lặp:
Mồi khơng nên chứa nhiều chuỗi lặp kép (ví dụ TATATATA) hoặc chuỗi lặp đơn (ví dụ TTTT) vì có thể gây ra hiện tượng bắt cặp nhầm (misprime). Trong một mồi, chỉ nên có tối đa 4 chuỗi lặp. Các chuỗi lặp cũng không nên xuất hiện nhiều lần trong 1 mồi.
Độ ổn định đầu 3’:
Tận cùng đầu 3’ (khoảng 5 nucleotide) khơng nên chứa tồn gốc G hoặc C vì có giá trị ΔG cao dễ dẫn tới bắt cặp không đặc hiệu vào khuôn. Trái lại nếu đầu 3’ chứa quá nhiều gốc T hoặc A sẽ khó bắt cặp.
Vùng thiết kế mồi của khuôn:
Vùng thiết kế mồi của khuôn không nên chứa quá nhiều cấu trúc thứ cấp. Nếu các cấu trúc thứ cấp này ổn định ở nhiệt độ gắn mồi thì mồi sẽ khơng thể bắt cặp được.