3.3.2.1. Thiết kế mồi
Cặp mồi đặc hiệu được thiết kế bằng phần mềm Vector NTI Advance 11.0 được công bố vào ngày 15/12/2008 - đây là phần mềm của hãng Invirogen,
Carlsbad (Jia et al., 2002). Phần mềm này có thể: phân tích trình tự đã lựa chọn
và thiết kế mồi PCR cho trình tự đó, dựa trên các thông số như nhiệt độ nóng chảy, %GC và chiều dài đoạn khuếch đại; phân tích phân tử ADN/ARN và xác định khung đọc mở (ORFs); phân tích phân tử ADN/ARN và xác định các vị trí giới hạn trên phân tử đó; sắp xếp thành hàng các trình tự của hai hoặc nhiều phân tử ADN/ARN; sử dụng để lắp ghép các đoạn ADN (cả các trình tự nguyên bản và sắc phổ) thành trình tự tiếp giáp dài hơn.
(https://www.thermofisher.com/vn/en/home/life-science/cloning/vector-nti-software/vector- nti-advance-software/vector-nti-advance-downloads/vector-nti-advance-archive.html)
Phương pháp thiết kế mồi để nhân đoạn gen mong muốn được thực hiện theo 8 bước sau:
Bước 1: Khởi động chương trình Vector NTI Advance 11.0, tạo dữ liệu trình tự ADN cần thiết kế mồi.
Bước 3: Thiết kế cặp mồi trong phần Primer Design
Bước 4: Kết quả về cặp mồi được thể hiện ở mục PCR Analysis
Hình 1.2. Phương pháp thiết kế mồi bằng phần mềm Vetor NTI 11.0
3.3.2.2. Kiểm tra mồi đối chiếu trên cơ sở dữ liệu
Bước 1: Cặp mồi thu được sau khi thiết kế bằng phần mềm Vertor Nti 11.0 được kiểm tra bằng phần mềm MEGA 6.0
Bước 2: Cặp mồi thu được sau khi thiết kế bằng phần mềm Vector NTI Advance 11.0 được kiểm tra bằng phần mềm Basic Local Alignment Search Tool (BLAST).
Bước 3: Kết quả tìm kiếm so sánh trình tự của đoạn mồi với cơ sở dữ liệu của thư viện trên NCBI
Hình 3.3. Phương pháp kiểm tra tính đặc hiệu của mồi bằng phần mềm MEGA 6.0 và BLAST
3.3.2.3. Kiểm tra mồi trong phòng thí nghiệm
- Mẫu lá lúa (3 tuần tuổi) được thu thập và tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB của (Obara et al., 1998) có cải tiến.
- Phản ứng PCR được tiến hành trên máy Veriti 96 giếng Thermal cycler. Tổng thể tích phản ứng là 15 µl, bao gồm: 5 µl ADN (nồng độ 10ng); 0,15 µM mồi; 0,2 mM dNTPs; 1X Buffer PCR; 2,5 mM MgCl2 và 0,25 đơn vị Taq polymerase.
- Sản phẩm PCR được điện di trên gel polyacrylamide 6,0% hoặc trên gel agarose và được phát hiện dưới tia cực tím bằng phương pháp nhuộm ethidium bromide.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN