3.2.1. Nguồn vật liệu
Cơ sở dữ liệu trình tự genome của 17 giống lúa kháng đạo ôn bản địa của Việt Nam được cung cấp bởi Trung tâm Tài nguyên Thực vật đã được giải trình tự thuộc đề tài "Nghiên cứu giải mã genome một số giống lúa địa phương của Việt Nam" của Viện Di truyền Nông nghiệp.
Bảng 3.1. Bảng vật liệu nghiên cứu
3.2.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
3.2.2.1. Dụng cụ thí nghiệm
Máy chủ sever, Máy li tâm eppendorf, máy đo pH HANNA, máy nhân bản gen (PCR), bộ máy điện di đứng CBS, bộ máy điện di ngang CBS, bộ chụp ảnh gel, tủ sấy memmert, cân phân tích, nồi hấp, tủ bảo quản mẫu 4°C, pipetman, ống eppendorf,…
TT Tên giống TT Tên giống
1 Khấu điển lư 10 Lúa gốc đỏ
2 Thơm Lài 11 Tám xoan Hải Hậu
3 OM6377 12 Hom râu
4 Nếp mặn 13 Khẩu Liến
5 Tốc lùn 14 Tám xoan Bắc Ninh
6 Ble te lo 15 Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2
7 Khấu mặc buộc 16 Nếp lùn
8 Nếp mèo nương 17 Nàng quớt biển
3.2.2.2. Hóa chất
a. Hoá chất tách chiết ADN
Hoá chất tách chiết ADN bao gồm các loại như: Tris HCl, EDTA, SDS, NaCl, CTAB, Chloroform, isopropanol, isoamyl alcohol, Ethanol của các hãng Sigma, Merck, Prolabo, ICN và Labscan.
-Đệm tách chiết ADN tổng số (đệm CTAB): CTAB 1%
Tris-HCl 0,1M EDTA 0,5M, pH 8,0 NaCl 5M
β-mercapthoethanol 14M -TBE 5x (Tris-borat buffer): Tris base Boric acid EDTA 0,5M, pH 8,0 TE buffer pH = 8,0 Tris 1M, pH = 8,0 NaCl 5M EDTA 0,5M, pH 8,0 b. Hoá chất dùng để chạy phản ứng PCR -Đệm PCR 1x (10 mM Tris-HCl pH8, 1,5 mM MgCl2, 5 mM KCl) hoặc đệm PCR 1x của Quiagen, Invitrogen.
- MgCl2 của Fermentas, Invitrogen.
-dNTPs (dATP, dGTP, dCT, dTTP) của Fermentas, Invitrogen.
-Mồi, Marker 1 kb, Marker GeneRulerTMADN Ladder Ultra Low của hãng Fermentas, Invitrogen.
-Taq polymerase của Fermentas, Invitrogen
c. Hoá chất chạy điện di
Điện di gel polyacrylamide gồm các hóa chất: acrylamide, APS, Temed, chất nhuộm Bromophenol blue, Ethidium bromide.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp tầm soát gen Pit và Pi21 dựa trên trình tự genome
Lắp ráp và gọi SNP sử dụng phần mềm NextGENe_V2.4.2.3 (SoftGenetics LLC, State College, PA, USA) (Biswas et al., 2015) . https://softgenetics.com /NextGENe.php và phần mềm phân tích di truyền tiến hóa phân tử MEGA 6.0 cho hệ điều hành Windows để dóng hàng và cột cho 17 giống lúa (http://www.megasoftware.net/mega.php) (Zheng, S et al., 2017; Tamura et al.,
2013; Huu Trung Khuat và cs., 2017).
Phương pháp tầm soát các gen được thực hiện theo 8 bước sau:
Bước 1: Khởi động chương trình NextGENe ver 2.4.2.3 chọn phương pháp đọc trình tự Illumila với ứng dụng SNP/Indel Discovery.
Bước 2: Đưa đữ liệu đầu vào bằng các file đọc trình tự ở dạng FastQ vào mục Sample files
Bước 3: Đưa dữ liệu tham chiếu vào mục Reference files dưới dạng Fasta
Bước 5: Sau khi đã thiết lập đủ các bước 1 đến bước 4 chúng ta tiến hành phân tích mẫu đọc trình tự đó với gene tham chiếu bằng cách bấm vào nút Run NextGENe
Bước 6: Kết quả thu được được thể hiện thông qua NextGENe Viewer
Bước 7: Sau khi dùng chương trình NextGENe ver 2.4.2.3 chúng ta thu được các trình tự tương đồng của mẫu giống cần so sánh với gene tham chiếu. Dùng lệnh Export để xuất ra file fasta giống cần so sánh, ứng dụng phần mềm
Mega ver 6.06 (Tamura et al., 2013) để dóng hàng dóng cột các giống cần so sánh với gen tham chiếu.
Bước 8: Kết quả dóng hàng, dóng cột các giống so sánh với gen tham chiếu, và xác định được các SNP và Indel.
Hình 3.1. Phương pháp tầm soát các gen Pit và Pi21 của 17 giống lúa đã giải trình tự bằng phần mềm NextGENe_V2.4.2.3 và MEGA 6.0
3.3.2. Phương pháp thiết kế mồi gen Pit và Pi21 kiểm tra gen kháng Pit, Pi21
3.3.2.1. Thiết kế mồi
Cặp mồi đặc hiệu được thiết kế bằng phần mềm Vector NTI Advance 11.0 được công bố vào ngày 15/12/2008 - đây là phần mềm của hãng Invirogen,
Carlsbad (Jia et al., 2002). Phần mềm này có thể: phân tích trình tự đã lựa chọn
và thiết kế mồi PCR cho trình tự đó, dựa trên các thông số như nhiệt độ nóng chảy, %GC và chiều dài đoạn khuếch đại; phân tích phân tử ADN/ARN và xác định khung đọc mở (ORFs); phân tích phân tử ADN/ARN và xác định các vị trí giới hạn trên phân tử đó; sắp xếp thành hàng các trình tự của hai hoặc nhiều phân tử ADN/ARN; sử dụng để lắp ghép các đoạn ADN (cả các trình tự nguyên bản và sắc phổ) thành trình tự tiếp giáp dài hơn.
(https://www.thermofisher.com/vn/en/home/life-science/cloning/vector-nti-software/vector- nti-advance-software/vector-nti-advance-downloads/vector-nti-advance-archive.html)
Phương pháp thiết kế mồi để nhân đoạn gen mong muốn được thực hiện theo 8 bước sau:
Bước 1: Khởi động chương trình Vector NTI Advance 11.0, tạo dữ liệu trình tự ADN cần thiết kế mồi.
Bước 3: Thiết kế cặp mồi trong phần Primer Design
Bước 4: Kết quả về cặp mồi được thể hiện ở mục PCR Analysis
Hình 1.2. Phương pháp thiết kế mồi bằng phần mềm Vetor NTI 11.0
3.3.2.2. Kiểm tra mồi đối chiếu trên cơ sở dữ liệu
Bước 1: Cặp mồi thu được sau khi thiết kế bằng phần mềm Vertor Nti 11.0 được kiểm tra bằng phần mềm MEGA 6.0
Bước 2: Cặp mồi thu được sau khi thiết kế bằng phần mềm Vector NTI Advance 11.0 được kiểm tra bằng phần mềm Basic Local Alignment Search Tool (BLAST).
Bước 3: Kết quả tìm kiếm so sánh trình tự của đoạn mồi với cơ sở dữ liệu của thư viện trên NCBI
Hình 3.3. Phương pháp kiểm tra tính đặc hiệu của mồi bằng phần mềm MEGA 6.0 và BLAST
3.3.2.3. Kiểm tra mồi trong phòng thí nghiệm
- Mẫu lá lúa (3 tuần tuổi) được thu thập và tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB của (Obara et al., 1998) có cải tiến.
- Phản ứng PCR được tiến hành trên máy Veriti 96 giếng Thermal cycler. Tổng thể tích phản ứng là 15 µl, bao gồm: 5 µl ADN (nồng độ 10ng); 0,15 µM mồi; 0,2 mM dNTPs; 1X Buffer PCR; 2,5 mM MgCl2 và 0,25 đơn vị Taq polymerase.
- Sản phẩm PCR được điện di trên gel polyacrylamide 6,0% hoặc trên gel agarose và được phát hiện dưới tia cực tím bằng phương pháp nhuộm ethidium bromide.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ TẦM SOÁT GEN PIT KHÁNG ĐẠO ÔN DỰA TRÊN DỮ LIỆU TRÌNH TỰ GENOME CỦA CÁC GIỐNG LÚA BẢN ĐỊA ĐÃ LIỆU TRÌNH TỰ GENOME CỦA CÁC GIỐNG LÚA BẢN ĐỊA ĐÃ ĐƯỢC GIẢI MÃ
Dựa trên cơ sở dữ liệu trình tự genome của 17 giống lúa kháng đạo ôn bản địa của Việt Nam được cung cấp bởi Trung tâm Tài nguyên Thực vật đã được giải trình tự, tiến hành tầm soát đối chiếu trình tự gen Pit lần lượt với từng trình tự genome của 17 giống lúa bằng phần mềm NextGENe V2.4.2.3.
Trình tự gen của gen Pit được lấy từ cơ sở dữ liệu của NCBI (https: //www.ncbi.nlm. nih.gov) và chuỗi tham chiếu được lấy từ cơ sở dữ liệu công bố (http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/sequence_display.cgi?orf=LOC_
Os01g05620) là LOC_Os01g05620 với trình tự bộ gen có 2970 nucleotide, vùng CDS (Coding DNA Sequence) có 2970 nucleotide (nu) mã hóa cho 989 amino acid. Vì trình tự bộ gen và vùng CDS của gen Pit đều có 2970 nucleotide nên gen
Pit không chứa vùng intron trong trình tự gen mà chỉ có chứa vùng exon mã hóa cho RNA thực hiện phiên mã.
Sử dụng phần mềm NextGENe V2.4.2.3 dựa vào trình tự genome của 17 giống lúa bản địa đã giải trình tự, tiến hành tìm trình tự tương đồng của 17 giống lúa đã giải trình tự và so sánh với locus gen Pit đã được công bố cho thấy đã tìm được 17 đoạn ADN tương đồng với trình tự gen Pit (LOC_Os01g05620) tương ứng với 17 giống lúa. Sự thay đổi về tỷ lệ T, C, A, G cũng như nucleotit tổng số giữa các giống lúa và so với giống tham chiếu được tổng hợp trong bảng 4.1 sẽ là cơ sở dữ liệu giúp xác định các SNP và các Indel khi chúng được phân tích kết hợp cùng với số liệu thống kê về trình tự nucleotit trong vùng CDS và trình tự mã hóa của các amino acid (Bảng 4.2). Phần mềm NextGENe là một trong những phần mềm có độ chính xác cao bên cạch các phần mềm CLC, Trinity, SOAP, Oases, ABySS trong việc tìm kiếm các đoạn trình tự tương đồng, các SNP, Indel từ thư viện hệ gen đã được giải trình tự của sinh vật (Wei Tang và Anna Y. Tang., 2019; Nikola Hájková et al., 2019).
Kết quả tầm soát trình tự gen Pit (LOC_Os01g05620) tham chiếu bằng phần mềm NextGENe V2.4.2.3 đã thu được ở mỗi giống có một đoạn trình tự tương đồng trên cả 17 giống lúa bản địa với tỷ lệ 100% 17/17 giống lúa (Bảng 3.1). Vào năm 2017, bằng một phương pháp tương tự đã tầm soát trình tự gen
SRWD2 tham chiếu (LOC_Os02g48964.1) bằng phần mềm NextGENe_V2.3 đã thu nhận được mỗi giống một đoạn trình tự ở chín giống Tẻ nương, Nếp mèo nương, Hom râu, Xương gà, Nàng quớt biển, Nếp bồ hóng Hải Dương, OM3536, IS1.2 and Một bụi đỏ trên 36 giống lúa bản địa Việt Nam: Tám xoan Bắc Ninh, Tám xoan Hải Hậu, Tẻ Nương, Nàng thơm chợ đào, Thơm Lài, Nếp mặn, Chiêm đỏ, Lúa Ngoi, Một bụi đỏ, Nàng cờ đỏ 2, Ble te lo, Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2, Nếp lùn, Khấu mặc buộc, OM6377, Chấn thơm, Xương gà, Khấu giáng, Coi ba đất, OM5629, Nếp bồ hóng Hải Dương, Tan ngần, Ba cho K’te, Blao sinh sai, Nàng quớt biển, Tép Thái Bình, Khấu điển lư, Nếp mèo nương, Tốc lùn, Hom râu, Nếp ông táo, OM3536, Khấu Liến, Lúa gốc đỏ, Chiêm đá, IS1.2 với tỷ lệ 25% 9/36 giống lúa (Huu Trung Khuat và cs., 2017).
Bảng 4.1 cho thấy đã thu nhận được 9 đoạn trình tự tương đồng của 9 giống lúa bản địa Việt Nam có độ dài ít hơn 3 nucleotide (nu) ở vị trí số 543, 544 và 545 so với gen tham chiếu Pit, đó là các giống: Khấu điển lư, Thơm Lài, OM6377, Tép Thái Bình, Tám xoan Hải Hậu, Hom râu, Khẩu Liến, Tám xoan Bắc Ninh và Nàng quớt biển. Tuy nhiên, đoạn trình tự tương đồng với gen Pit
của 9 giống lúa trên có tỉ lệ phần trăm các loại C, A, G và T(U) có sự khác nhau và khác với gen tham chiếu (Bảng 4.1).
8/17 giống còn lại (Nếp mặn, Lúa gốc đỏ, Ble te lo, Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2, Nếp lùn, Khấu mặc buộc, Nếp mèo nương và Tốc lùn) có độ dài ít hơn 20 nucleotide so với gen tham chiếu trong đó mất 3 nu như 9 giống ở trên và mất thêm 17 nu ở vị trí từ số 2647 đến 2664 (Hình 4.1). Tám đoạn trình tự của tám giống này có tỷ lệ A, T(U), G, C sai khác so với gen tham chiếu (Bảng 4.1).
Bảng 4.1. Bảng thống kê số lượng và tỉ lệ nucleotide của các gen Pit ở các giống lúa đã giải trình tự
Tên giống lúa và gen tham chiếu
Tỷ lệ nucleotide (%)
Tổng số nucleotide T(U) C A G CG AT
LOC_Os01g05620 (PIT) 27,6 19,1 30,2 23,1 42,2 57,8 2970,0 Khấu điển lư 27,0 19,1 31,0 22,9 42,0 58,0 2967,0 Thơm Lài 26,7 19,2 31,5 22,6 41,8 58,2 2967,0 OM6377 27,0 19,1 31,4 22,5 41,7 58,3 2967,0 Tép Thái Bình 26,4 19,4 31,9 22,3 41,7 58,3 2967,0
Tám xoan Hải Hậu 26,8 19,3 31,1 22,8 42,1 57,9 2967,0 Hom râu 26,9 19,2 31,0 22,9 42,1 57,9 2967,0 Khẩu Liến 26,9 19,2 30,9 23,0 42,2 57,8 2967,0 Tám xoan Bắc Ninh 26,3 19,4 31,6 22,7 42,1 57,9 2967,0 Nàng quớt biển 26,7 19,4 31,1 22,8 42,2 57,8 2967,0 Nếp mặn 26,6 19,2 31,4 22,8 42,0 58,0 2950,0 Tốc lùn 27,2 18,9 30,8 23,1 42,0 58,0 2950,0 Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2 27,1 19,1 30,8 23,0 42,1 57,9 2950,0 Nếp lùn 26,7 19,2 31,4 22,7 41,9 58,1 2950,0 Ble te lo 26,6 19,4 31,2 22,8 42,2 57,8 2950,0 Khấu mặc buộc 26,8 19,2 31,1 23,0 42,2 57,8 2950,0 Nếp mèo nương 26,7 19,2 31,2 22,9 42,1 57,9 2950,0 Lúa gốc đỏ 26,8 19,2 31,2 22,8 42,0 58,0 2950,0 Hình 4.1. Ảnh dóng hàng, dóng cột so sánh trình tự một đoạn gen kháng đạo ôn Pit của một số giống lúa bản địa
Hình 4.2. Vị trí 3 nucleotide bị thiếu ảnh hưởng làm mất 2 amino acid sau khi dịch mã
Kết quả tầm soát bằng phần mềm NextGENe V2.4.2.3 cho thấy 17/17 giống lúa bản địa đều xuất hiện một đoạn trình tự tương đồng và thông qua việc để dóng hàng, cột bằng phần mềm MEGA 6.0 cho thấy chỉ có 9/17 giống mang gen
Pit với tỷ lệ 52,94%. Trong khi đó, Khuất Hữu Trung và cộng sự nghiên cứu tầm soát gen SRWD2 được kết quả là 9/36 giống lúa bản địa xuất hiện một đoạn trình tự tương đồng và thông qua việc dóng hàng, cột bằng phần mềm MEGA 6.0 cho thấy chỉ 1/9 giống mang gen SRWD2 với tỷ lệ 11,11%.
Sau khi sử dụng phần mềm MEGA 6.0 để dóng hàng, cột so với gen Pit tham chiếu, tiến hành dịch mã cho thấy 3 nu bị thiếu làm mất 2 amino acid sau khi dịch mã (Hình 4.2) (Zheng, S et al., 2017; Tamura et al., 2013; Huu Trung Khuat và cs., 2017). Kết quả phân tích tổng số amino acid và dịch mã sang protein cho thấy 9 giống lúa Khấu điển lư, Thơm Lài, OM6377, Tép Thái Bình, Tám xoan Hải Hậu, Hom râu, Khẩu Liến, Tám xoan Bắc Ninh và Nàng quớt biển có chiều dài tương đương với gen tham chiếu (ít hơn 3 nucleotide) nhưng lại có số lượng các amino acid khác nhau và có sự sai khác về trình tự protein (Bảng 4.2).
Thông qua việc phân tích tổng số amino acid (aa) và thành phần amino acid của gen Pit cho thấy tổng số amino acid của 17 giống lúa dao động từ 980 đến 987 aa. Trong đó Leucine thu được số amino acid nhiều nhất, dao động từ 140 đến 144 aa và Tryptophan thu được số aa ít nhất, dao động từ 15 đến 16 aa. Kết quả tầm soát 17 giống lúa nghiên cứu thu được 9 giống lúa: Khấu điển lư, Thơm Lài, OM6377, Tép Thái Bình, Tám xoan Hải Hậu, Hom râu, Khẩu Liến, Tám xoan Bắc Ninh và Nàng quớt biển có tổng số amino acid và thành phần amino acid tương đồng giống với gen tham chiếu (987 với 989 amino acid). Sáu giống: Nếp mặn, Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2, Nếp lùn, Ble te lo, Khấu mặc buộc và Nếp mèo nương có tổng số amino acid là 981 amino acid nhưng số lượng từng amino acid khác so với gen tham chiếu. Hai giống Tốc lùn và Lúa gốc đỏ còn lại có tổng số amino acid ít hơn 9 aa gen tham chiếu (Bảng 4.2).
4.2. KẾT QUẢ THIẾT KẾ CHỈ THỊ XÁC ĐỊNH GEN PIT CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG ĐẠO ÔN KHÁNG ĐẠO ÔN
Kết quả tầm soát và so sánh trình tự locus gen Pit của 17 giống lúa bản địa với gen kháng đạo ôn bằng các phần mềm chuyên dụng cho thấy: tần số xuất hiện các đa hình đơn nucleotide (SNPs) và các đoạn thêm, bớt (InDels) giữa các giống khá cao. Đặc biệt, có đoạn trình tự được chèn vào với 17 nucleotide đối với 9 giống lúa bản địa của Việt Nam giống như gen tham chiếu đã được công bố, đó là: Khấu điển lư, Thơm Lài, OM6377, Tép Thái Bình, Tám xoan Hải Hậu, Hom râu, Khẩu Liến, Tám xoan Bắc Ninh và Nàng quớt biển (Hình 4.1).
Các chỉ thị phân tử liên kết với các gen kháng chính là một công cụ quan trọng cho việc chọn tạo giống bằng phương pháp MAS (Costanzo et al., 2009). Các biến thể về đơn đa hình Nucleotide (SNPs) và thêm, bớt (InDels) trong toàn bộ phân đoạn gen có thể được so sánh giữa các kiểu gen, xác định các dấu hiệu sai khác trong quá trình hỗ trợ lựa chọn gen cho chính xác. Các dấu hiệu liên kết với hai gen kháng (Pib và Pita) cũng như các dấu SNP dựa trên PCR cho locus
Piz và Pik (Hayashi et al., 2004; Jia et al., 2009; Zhai et al., 2011) đã đề cập đến. Do đó, việc chọn tạo giống bằng phương pháp MAS sẽ được hưởng lợi từ sự phát triển của các chỉ thị đặc hiệu gen kháng mới, cho phép tích hợp nhiều gen để thực hiện khả năng kháng bệnh phổ rộng hơn.
Bảng 1.2. Bảng thống kê số lượng amino acid của các gen ứng viên Pit ở các giống lúa đã giải trình tự
Tên giống/ gen
tham chiếu Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gln Arg Ser Thr Val Trp Tyr Tổng
LOC
Os01g05620(PIT) 41 24 55 67 38 54 28 67 61 143 29 49 40 38 52 65 35 64 16 23 989