Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.3. Kết quả tầm soát gen Pi21 kháng đạo ôn dựa trên dữ liệu trình tự genome của
LIỆU TRÌNH TỰ GENOME CỦA CÁC GIỐNG LÚA BẢN ĐỊA ĐÃ ĐƯỢC GIẢI MÃ
Hình 4.7. Ảnh điện di sản phẩm PCR đối với cặp mồi Pit nhận biết gen Pit ở các giống lúa bản địa của Việt Nam (thứ tự các mẫu theo bảng 3.1)
Dựa trên cơ sở dữ liệu trình tự genome của 17 giống lúa kháng đạo ôn bản địa của Việt Nam được cung cấp bởi Trung tâm Tài nguyên Thực vật đã được giải trình tự, tiến hành tầm sốt đối chiếu trình tự gen Pi21 lần lượt với từng trình tự genome của 17 giống lúa bằng phần mềm NextGENe V2.4.2.3.
Trình tự gen của gen Pi21 được lấy từ cơ sở dữ liệu của NCBI (https:
//www.ncbi.nlm. nih.gov) và chuỗi tham chiếu được lấy từ cơ sở dữ liệu công bố (http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/sequence_display.cgi?orf= LOC_Os04 g32850) là LOC_Os04g32850 có 1762 nucleotide, vùng CDS (Coding DNA Sequence) có 801 nucleotide mã hóa cho 266 amino acid. Nên trình tự ADN của gen Pi21 có chứa 961 nucleotide ở vùng intron không phiên mã và 801
nucleotide ở vùng exon mã hóa cho RNA thực hiện phiên mã khác với trình tự bộ gen và vùng CDS của gen Pit đều có 2970 nucleotide chỉ có chứa vùng exon mã hóa cho RNA thực hiện phiên mã.
Kết quả tầm sốt trình tự gen Pi21 (LOC_ Os04g32850) tham chiếu bằng phần mềm NextGENe V2.4.2.3 đã thu được ở mỗi giống có một đoạn trình tự tương đồng trên cả 17 giống lúa bản địa với tỷ lệ 100% 17/17 giống lúa (Bảng 3.1). Kết quả này có tỷ lệ giống với kết quả tầm sốt trình tự gen Pit
(LOC_Os01g05620) tham chiếu ở mỗi giống có một đoạn trình tự tương đồng trên cả 17 giống lúa bản địa với tỷ lệ 100% 17/17 giống lúa (Bảng 3.1).
Sử dụng phần mềm NextGENe_V2.4.2.3 dựa vào trình tự genome của 17 giống lúa bản địa đã giải trình tự, tiến hành tìm trình tự tương đồng của 17 giống lúa đã giải trình tự và so sánh với locus gen Pi21 đã được công bố cho thấy đã tìm được 17 đoạn ADN tương đồng với trình tự gen Pi21 (LOC_ Os04g32850) tương ứng với 17 giống lúa. Sự thay đổi về tỷ lệ T, C, A, G cũng như nucleotit tổng số giữa các giống lúa và so với giống tham chiếu được tổng hợp trong bảng 4.3 sẽ là cơ sở dữ liệu giúp xác định các SNP và các Indel khi chúng được phân tích kết hợp cùng với số liệu thống kê về trình tự nucleotit trong vùng CDS và trình tự mã hóa của các amino acid (Bảng 4.4).
Kết quả (Bảng 4.3) đã thu nhận được 9 đoạn trình tự tương đồng có độ dài bằng với gen tham chiếu Pi21, đó là các giống: Khẩu Liến, Tám xoan Bắc Ninh, Ble te lo, OM6377, Tép Thái Bình, Nàng quớt biển, Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2, Nếp lùn, Lúa gốc đỏ. Tuy nhiên, đoạn trình tự của 3 giống Khẩu Liến, Tám xoan Bắc
Ninh, Ble te lo có tỉ lệ phần trăm các loại C, A, G và T(U) giống nhau và giống với gen tham chiếu. Sáu giống OM6377, Tép Thái Bình, Nàng quớt biển, Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2, Nếp lùn, Lúa gốc đỏ tuy có tổng số nucleotide giống với gen tham chiếu nhưng có tỉ lệ phần trăm các loại C, A, G và T(U) giống nhau và không giống với gen tham chiếu.
Tám đoạn trình tự tương đồng của các giống còn lại: Khấu điển lư, Tám xoan Hải Hậu, Hom râu, Khấu mặc buộc, Nếp mèo nương, Thơm Lài, Nếp mặn, Tốc lùn có độ dài ít hơn 24 nucleotide so với gen tham chiếu Pi21 ở vị trí 237 đến 260 trên LOC_Os01g05620 CDS (Hình 4.8). Tuy nhiên, đoạn trình tự tương đồng với gen Pi21 của 8 giống lúa trên có tỉ lệ phần trăm các loại C, A, G và T(U) không giống nhau và khơng giống với gen tham chiếu. Trong đó 5 giống: Khấu điển lư, Tám xoan Hải Hậu, Hom râu, Khấu mặc buộc, Nếp mèo nương có tỉ lệ phần trăm các loại C, A, G và T(U) giống nhau cịn 3 giống: Thơm Lài, Nếp mặn, Tốc lùn có tỉ lệ phần trăm các loại C, A, G và T(U) giống nhau.
Bảng 4.3. Bảng thống kê số lượng và tỉ lệ nucleotide của các gen Pi21 ở các giống lúa đã giải trình tự
Tên giống lúa và gen tham chiếu Tỷ lệ nucleotide (%) Tổng số T(U) C A G CG AT nucleotide LOC Os04g32850(Pi21) 12,9 34,4 18,6 34,1 68,5 31,5 801,0 Khẩu Liến 12,9 34,4 18,6 34,1 68,5 31,5 801,0 Tám xoan Bắc Ninh 12,9 34,4 18,6 34,1 68,5 31,5 801,0 Ble te lo 12,9 34.4 18,6 34,1 68,5 31,5 801,0 OM6377 12,7 34,6 18,6 34,1 68,7 31,3 801,0 Tép Thái Bình 12,7 34,6 18,6 34,1 68,7 31,3 801,0 Nàng quớt biển 12,7 34,6 18,6 34,1 68,7 31,3 801,0 Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2 12,7 34,6 18,6 34,1 68,7 31,3 801,0 Nếp lùn 12,7 34,6 18,6 34,1 68,7 31,3 801,0 Lúa gốc đỏ 12,7 34,6 18,6 34,1 68,7 31,3 801,0 Khấu điển lư 13,0 34,0 19,0 34,0 68,0 32,0 777,0 Tám xoan Hải Hậu 13,0 34,0 19,0 34,0 68,0 32,0 777,0 Hom râu 13,0 34,0 19,0 34,0 68,0 32,0 777,0
Khấu mặc buộc 13,0 34,0 19,0 34,0 68,0 32,0 777,0 Nếp mèo nương 13,0 34,0 19,0 34,0 68,0 32,0 777,0 Thơm Lài 12,9 34,1 19,0 34,0 68,1 31,9 777,0 Nếp mặn 12,9 34,1 19,0 34,0 68,1 31,9 777,0 Tốc lùn 12,9 34,1 19,0 34,0 68,1 31,9 777,0
Kết quả sử dụng phần mềm MEGA 6.0 để dóng hàng, cột so với gen Pi21 tham chiếu, tiến hành dịch mã cho thấy 24 nu bị thiếu ở 8 giống ; Khấu điển lư, Tám xoan Hải Hậu, Hom râu, Khấu mặc buộc, Nếp mèo nương, Thơm Lài, Nếp mặn, Tốc lùn làm mất 9 amino acid sau khi dịch mã (Bảng 4.4) (Zheng, S et al., 2017; Tamura et al., 2013; Huu Trung Khuat và cs., 2017).
Kết quả phân tích tổng số amino acid và thành phần amino acid của gen Pi21 cho thấy tổng số amino acid của 17 giống lúa dao động từ 257 đến 266 aa. Trong đó Proline thu được số amino acid nhiều nhất, dao động từ 67 đến 73 aa và Tryptophan thu được số aa ít nhất chỉ có 1 amino acid. Kết quả tầm soát 17 giống lúa nghiên cứu thu được 3 giống lúa: Khẩu Liến, Tám xoan Bắc Ninh và Ble te lo có tổng số amino acid và thành phần amino acid tương đồng giống với gen tham chiếu (266 amino acid). Sáu giống: OM6377, Tép Thái Bình, Nàng quớt biển, Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2, Nếp lùn và Lúa gốc đỏ có tổng số amino acid là 266 amino acid nhưng số lượng từng amino acid khác so với gen tham chiếu. Tám giống: Khấu điển lư, Tám xoan Hải Hậu, Hom râu, Khấu mặc buộc, Nếp mèo nương, Thơm Lài, Nếp mặn, Tốc lùn cịn lại có tổng số amino acid ít hơn 9 aa gen tham chiếu (Bảng 4.4).
Hình 4.8. Ảnh dóng hàng, dóng cột so sánh trình tự một đoạn gen kháng đạo ơn Pi21 của một số giống lúa bản địa