a. Nuôi cấy vi khuẩn
Khủ trùng mặt ngoài cơ thể cá bằng cồn 700 . Sau khi mổ cá khử trùng các cơ quan, dùng que cấy đã đốt nóng trên ngọn lửa đèn cồn vào các cơ quan cần lấy mẫu và cấy lên đĩa thạch agar. Lật ngược đĩa ghi các thông tin cần thiết. Sau đó ủ các đĩa môi trường này trong tủ ấm ở nhiệt độ 28 – 30oC từ 24 – 48 giờ. Sau 24h kiểm tra sự phát triển của khuẩn lạc. Dựa vào màu sắc, hình dạng, kích thước khuẩn lạc để phân biệt các loại khuẩn lạc có trên đĩa lồng, từ đó chọn ra loại khuẩn lạc nghi ngờ.
b. Nuôi cấy thuần chủng
Dùng que cấy đã đốt nóng trên ngọn lửa đèn cồn, chọn khuẩn lạc trên đĩa trang, ria 4 – 5 lần trên mặt thạch ở một góc đĩa lồng ta được đường cấy 1. Đốt nóng que cấy và ria cấy từ đường cấy 1 trên 1/3 đĩa được đường cấy thứ 2, tiếp
Mẫu bệnh
Nuôi cấy phân lập
Nuôi cấy thuần chủng
Hình thái khuẩn lạc Nhuộm Gram Thử phản úng sinh hóa
tục làm như vậy ta được vi khuẩn đường cấy 3. Lật ngược đĩa ghi các thông tin cần thiết. Sau đó nuôi cấy mẫu ở nhiệt độ 28 – 30oC từ 24 – 48 giờ.
c. Phương pháp nghiên cứu hình thái vi khuẩn
Để nghiên cứu hình thái vi khuẩn người ta tiến hành phương pháp nhuộm gram. Nhuộm gram các bước tiến hành như sau: sau khi được giống vi khuẩn thuần, lấy mẫu phết lên lam, cho thêm 1 đến 2 giọt nước muối sinh lý vô trùng, dùng đầu que cấy dàn mỏng lên lam kính. Để mẫu tự khô ở nhiệt độ trong phòng. Hơ cao lam kính có mẫu trên ngọn lửa đèn cồn, để cố định vi khuẩn. Nhỏ dung dịch 1 (tím tinh thể ) lên lam đã cố định vi khuẩn: để từ 30-60 giây, rửa nhanh qua nước rồi vảy khô lam. Nhỏ dung dịch 2 (Lugol) để trong 1 phút, rửa nhanh qua nước rồi vảy khô lam. Để nghiêng lam rồi nhỏ dung dịch 3 (Cồn Aceton) cho cồn chảy qua vi khuẩn để tẩy màu, rửa nhanh qua nước rồi vảy khô lam. Nhỏ dung dịch 4 (Safranin) để từ 1-2 phút , rửa nhanh qua nước để khô tự nhiên. Ta đem soi vi khuẩn bằng kính hiển vi từ vật kính 10-40-100 để quan sát hình dạng và màu sắc của vi khuẩn.
Vi khuẩn có màu xanh tím : gram +; Vi khuẩn có màu hồng : gram –
d. Thử phản ứng sinh hóa của vi khuẩn
Để định đanh vi khuẩn tôi tiến hành bằng bộ kít thử API 20E. Dùng que cấy vô trùng lấy một khuẩn lạc trên đĩa thạch có vi khuẩn thuần chủng đem pha loãng vi khuẩn để tạo dung dịch huyền phù trong ống Effendorf chứa nước muối 2%. Dùng dung dịch huyền phù đó nhỏ vào các giếng có sẵn trong test API 20E. Mang test vi khuẩn đã thử để trong tủ ấm 24h rồi lấy ra đọc kết quả. Bên cạnh đó thử thêm phản ứng O/F. Tất cả các thao tác đều làm bên cạnh ngọn lửa đèn cồn, dụng cụ và hóa chất sử dụng đều phải đảm bảo vô trùng.
e. Phân loại vi khuẩn
- Dựa vào những đặc điểm sinh lý và kết quả thử phản ứng sinh hoá phân loại vi khuẩn dựa vào tài liệu cẩm nang cho phân loại và nhận dạng vi khuẩn gây bệnh (Frerichs and Millar, 1993).
3.3.1.3. Phương pháp mô bệnh học
Để nghiên cứu các biến đổi bệnh lý trong mô và tế bào của các tổ chức cá bệnh và xác định cá Chim vây vàng bị bệnh có nhiễm virus hoại tử thần kinh (VNN), bệnh cá ngủ (IRDO) hay không tiến hành làm tiêu bản mô bệnh học đối với cá Chim vây vàng có biểu hiện bệnh thu ở vịnh Vân phong Khánh Hòa.
Quá trình làm tiêu bản mô bệnh học được tóm tắt trong sơ đồ sau: