QUY TRÌNH LÀM TIÊU BẢN MÔ BỆNH HỌC.
Thu mẫu
Thu mẫu bệnh: chọn những cá thể có bệnh tích điển hình.
Cố định mẫu
Dùng dao giải phẫu sắc cắt các mô cần nghiên cứu (gan, thận, não, mang, cơ, ruột, mắt) thành những miếng nhỏ, thể tích miếng mô nhỏ hơn 1 cm3. Cho miếng mô vào dung dịch cố định Buffered formalin 10% trong 24h. Thể tích dung dịch cố định gấp 10 lần thể tích miếng mô. Sau 24-48h phải tiến hành thay mẫu sang dung dịch cồn 700 và bảo quản đến khi xử lý mẫu. Các thao tác phải nhanh, cho ngay vào dung dịch cố định tránh để mẫu quá lâu trong không khí, ghi đầy đủ lý lịch và dán nhãn cho từng mẫu
Mẫu cá Cố định mẫu (Buffer formaline mặn) Xử lý mẫu Đúc mẫu (Parafine), cắt mẫu Nhuộm mẫu (Haematoxyline & eosin) Đọc kết quả (Kính hiển vi QH)
Xử lý mẫu
Sau khi cố định, mẫu mô sẽ cứng lại. Dùng dao sạch cắt miếng mô thành những miếng nhỏ hơn, từ 0,2 - 0,5cm chiều rộng, 0,2 - 0,5cm bề dày và không quá 2cm chiều dài. Cho mẫu vào các cassettes đã ghi nhãn và đậy nắp cassettes lại. Xử lý mẫu mô bằng máy xử lý mẫu tự động. Khử nước ở mẫu bằng dung dịch cồn có nồng độ tăng dần. Làm sạch mẫu trong xylen. Cuối cùng thấm paraffin cho mẫu sau khi đã làm sạch.
Bảng 3.2. Thời gian khử nước, làm sạch và thấm parafin
STT Hóa chất Thời gian (phút)
1 50% Alcohol 30 – 60 2 70%Alcohol 30 – 60 3 95% I Alcohol 30 – 60 4 95% II Alcohol 30 – 60 5 95% III Alcohol 30 – 60 6 100% I Alcohol 30 - 60 7 100% II Alcohol 30 – 60 8 100% III Alcohol 30 – 60 9 100% I Xylene (Chloroform I) 60 – 90 10 100% II Xylene (Chloroform II) 60 – 90
11 Paraplast I 90
12 Paraplast II 120
Đúc paraffin
- Sau khi mẫu đã thấm parafin, đặt mẫu vào khuôn đúc, rót parafin nóng chảy vào khuôn. Chỉnh sửa mẫu theo hướng cần cắt và đậy cassettes lên. Đặt khuôn lên dàn lạnh cho đến lúc parafin đông cứng lại. Gỡ khối parafin ra khỏi khuôn và gọt thành từng khối hình thang cân.
Cắt mẫu
Ta gắn khối parafin chứa mẫu lên máy cắt mô Mycrotom. Dùng tay quay cắt thành từng lát mỏng 0,4 – 0,5 µm. Khi các lát cắt được cắt ra tạo thành dải băng mỏng từ lưỡi dao của máy thì dùng kẹp hoặc que nhỏ thả dải mô trên nước ấm 45-480C để các lát cắt được dãn phẳng ra. Dùng kẹp nhẹ nhàng tách các lát từ dải mỏng với độ dài thích hợp, chọn những đoạn mẫu đẹp, phẳng, gọn. Lấy một lam kính sạch luồn xuống dưới lát cắt để vớt chúng từ nước ấm lên. Các lam kính được ghi nhãn. Sấy khô các lam kính 2-3h trong tủ sấy 400C
Nhuộm màu
Lấy các lam kính đã sấy khô và xếp vào khay rồi tiến hành nhuộm màu Haematoxylin và Eosin
Quá trình nhuộm được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.3. Thời gian nhuộm màu H&E
STT Hóa chất Thời gian (phút)
1 100 % Xylene I 2-3 2 100 % Xylene II 2-3 3 100% Alcohol I 2-3 4 100% Alcohol II 2-3 5 95% Alcohol 2-3 6 70% Alcohol 2-3
7 Rinsing in tap water 2-3
8 Haematoxylin 4 - 8
9 Quickdip I 1 - 3 seconds
10 Running in tap water 4- 6
11 Eosin 5 - 10 12 Quickdip II 1 - 3 seconds 13 75% Alcohol 2-3 14 95% Alcohol 2-3 15 100% Alcohol I 2-3 16 100% Alcohol II 2-3 17 Xylene I 2-3 18 Xylene II 2-3
Sau đó các lam kính được gắn cố định bằng Bom Canada (vừa cố định vĩnh viễn, vữa giúp bảo quản mẫu).
Đọc kết quả
Các tiêu bản mẫu được đọc dưới kính hiển vi với độ phóng đại tăng dần để quan sát các biểu hiện bất thường của mô bệnh.
3.3.2. Thí nghiệm cảm nhiễm trong điều kiện in vivo để xác định tác nhân gây bệnh là vi khuẩn gây bệnh là vi khuẩn
Vi khuẩn dùng cho cảm nhiễm: Từ kết quả nuôi cây phân lập vi khuẩn từ mẫu cá bệnh ta chọn ra vi khuẩn Vibrio alginolyticus có tần suất bắt gặp cao để dùng cảm nhiễm ngược vào cá khỏe.
Cá trong thí nghiệm cảm nhiễm: Cá Chim vây vàng (có chiều dài 8- 10cm) được chuyển tử trại nuôi cá biển vịnh Vân Phong – Khánh Hòa. Các con cá này hoàn toàn khỏe mạnh, không bộc lộ các dấu hiệu bệnh lý ở ngoài và trong
cơ thể cá. Năm mẫu cá đã được giải phẫu để kiểm tra đầu vào trước khi tiến hành thí nghiệm và tìm vị trí an toàn nhất để tiêm huyền dịch vi khuẩn vào ổ bụng của cá. Cá được đưa về cơ sở thực nghiệm 1 tuần trước khi thí nghiệm bắt đầu.
Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm
Cá thí nghiệm được bố trí vào 7 bể với mật độ 5 con/ bể, trong đó 6 bể là thí nghiệm và 1 bể là đối chứng. Thí nghiệm được thực hiện trong các thùng nhựa 120 lít, trong nhiệt độ 290C, pH 7 - 8, độ muối 30%0, lặp lại đồng thời 3 lần, sục khí liên tục, thay nước đồng loạt 30% - 50% khi thấy nước đục.Vi khuẩn sau khi lắc đều được tiêm vào cá để gây nhiễm cho cá khỏe ở hai nồng độ 10^4 cfu/ml, 10^6 cfu/ml (xác định mật độ bằng phương pháp MacFaland), bằng phương pháp tiêm vi khuẩn vào xoang bụng cá với liều 0,1 ml/con; cá ở nghiệm thức đối chứng được tiêm nước muối sinh lý 0,85% vô trùng 0,1 ml/con.
Sau khi tiêm, cá được chăm sóc và theo dõi trong vòng 14 ngày. Sức khỏe của cá, các dấu hiệu bệnh lý, tỷ lệ cá chết.
Cách bố trí thí nghiệm: