Parvovirus gây ra
4.2.2. Kết quả kiểm tra sự có mặt của virus trong mẫu phân lập bằng phương pháp PCR
Sau khi thu được 4 chủng Parvovirus gây bệnh tích tế bào đặc trưng trên môi trường tế bào CRFK và sau đó dịch virus ở đời thứ 3 được lựa chọn để kiểm tra sự có mặt của Parvovirus. Dịch virus được thu lại và kiểm tra bằng phương pháp PCR một lần nữa để giám định lại sự phát triển và nhân lên của virus và khẳng định sự biến đổi của tế bào CRFK quan sát được là do Parvovirus gây nên,
mà không phải do nguyên nhân khác như sai sót trong khâu chuẩn bị, hoặc bệnh tích được gây ra bởi 1 virus khác.
Dịch virus thu được sau phân lập trên tế bào CRFK được lấy ra để tiến hành tách chiết DNA theo hướng dẫn của kit hãng Qiagen. Phản ứng PCR được thực hiện (theo các bước đã trình bày trong phần 3.4.3) với cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di kiểm tra. Kết quả cho thấy mẫu đối chứng âm (N) âm tính, tại giếng đối chứng dương (P) và giếng biểu thị kết quả của các mẫu. Xuất hiện một băng sáng nét, kích thước 550bp theo đúng thiết kế. Như vậy có thể khẳng định bệnh tích trên tế bào và virus phân lập được là Parvovirus.
Trên thế giới, nghiên cứu phân lập Parvovirus trên dòng tế bào CRFK
(Crandell Feline Kidney) được sử dụng trong nhiều quốc gia (Mochizuki M et
al. 1996; Parthiban S et al., 2011). Cho đến thời điểm hiện tại, kết quả nghiên
cứu của chúng tôi thực hiện phân lập thành công Parvovirus trên dòng tế bào một lớp CRFK là đầu tiên tại Việt Nam. Từ đó, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu các đặc tính sinh học của Parvovirus trên môi trường tế bào CRFK.
4.3. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC VỦA PARVOVIRUS 4.3.1. Kết quả nghiên cứu khả năng gây bệnh tích tế bào của Parvovirus 4.3.1. Kết quả nghiên cứu khả năng gây bệnh tích tế bào của Parvovirus
Để xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của Parvovirus, nghiên cứu tiến hành cấy truyền đời các chủng virus đến đời P#5. Thời điểm thu virus khi bệnh tích tế bào đạt 80-90%. Tại đời P#5, nghiên cứu sẽ xác định khả
năng gây bệnh tích tế bào của các chủng Parvovirus phân lập. Việc xác định
khả năng gây bệnh tích tế bào được tiến hành trên môi trường tế bào CRFK với nồng độ MOI = 0,1. Sau khi gây nhiễm sẽ cố định thời gian theo dõi sự xuất hiện bệnh tích tế bào. Thông thường sau gây nhiễm định kỳ 12 giờ sẽ quan sát hình thái tế bào để phát hiện bệnh tích và theo dõi cho đến khi bệnh tích tế bào phát triển 100%. Trong nghiên cứu này thời gian theo dõi được tính từ khi gây nhiễm đến khi có bệnh tích tế bào hoàn toàn là 4 ngày. Kết quả theo dõi khả năng gây bệnh tích tế bào của các chủng Parvovirus được trình bày ở bảng 4.7.
Bảng 4.7. Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của các chủng Parvovirus phân lập được
(tính theo % diện tích tế bào bị phá hủy so với tổng số diện tích đáy bình nuôi cấy)
STT Chủng virus CPE theo thời gian sau khi gây nhiễm virus
24hpi 36hpi 48hpi 60hpi 72hpi 84hpi 96hpi
1 VNUA-C17 - * 20 50 80 100 B
2 VNUA-C31 - 10 50 70 90 B
3 VNUA-C32 - * 30 50 80 100 B
4 VNUA-C35 - 10 40 65 85 B
*: CPE dưới 5%
10%: số % tế bào bị phá hủy so với tổng diện tích bề mặt nuôi cấy B: Tế bào bong tróc hoàn toàn khỏi bề mặt nuôi cấy
hpi: hour post inoculation (giờ sau gây nhiễm virus)
a) CPE 24h b) CPE 48h c) CPE 72h d) CPE 96h
Hình 4.5. Hình ảnh bệnh tích tế bào do Parvovirus gây ra trên tế bào CRFK tại các thời điểm khác nhau
Qua bảng 4.7, nghiên cứu chỉ ra rằng Parvovirus bắt đầu gây bệnh tích tế
bào từ 36 giờ đến 48 giờ sau khi gây nhiễm và phá hủy hoàn toàn tế bào sau 72 giờ đến 84 giờ. Tuy nhiên thời gian phá hủy tế bào sớm hay muộn tùy thuộc vào từng chủng virus, điều này phụ thuộc vào khả năng gây bệnh tích của từng chủng virus khác nhau. Bên cạnh đó công tác lấy mẫu được chuẩn bị và tiến hành tốt cũng có ý nghĩa quan trọng trong việc giữ cho virus sống sót và bảo toàn độc lực,
ngược lại thu thập và bảo quản mẫu không đúng quy trình sẽ làm virus giảm độc lực hoặc chết điều này ảnh hưởng trực tiếp tới việc phân lập giữ giống virus.
4.3.2. Kết quả xác định hiệu giá của các chủng Parvovirus nghiên cứu
Kết quả xác định hiệu giá TCID50 của virus được tính theo công thức Reed
Muench được trình bày ở bảng 4.8.
Bảng 4.8. Hiệu giá của các chủng Parvovirus phân lập STT Chủng virus Hiệu giá virus TCID50/25µl STT Chủng virus Hiệu giá virus TCID50/25µl
1 VNUA-C17 4,83x106
2 VNUA-C31 3,16x105
3 VNUA-C32 6,67x105
4 VNUA-C35 3,16x106
Qua bảng 4.8 thấy, hiệu giá virus thấp nhất được xác định là chủng virus
VNUA-C31 với giá trị là 3,16x105 TCID50/25µl, hiệu giá virus cao nhất được xác
định là chủng VNUA-C17 với giá trị là 4,83x106 TCID50/25µl. Hai chủng
VNUA-C32 và VNUA-C35 lần lượt có giá trị là 6,67x105 TCID50/25µl và
3,83x105 TCID50/25µl. Như vậy, các chủng Parvovirus đều có hiệu giá tương đối
cao, có khả năng phát triển và nhân lên tốt trên môi trường tế bào CRFK.
4.3.3. Xác định quy luật nhân lên của virus Parvo trên môi trường tế bào CRFK
Sau khi xác định hiệu giá của các chủng Parvovirus trên môi trường tế bào CRFK, chúng tôi xác định quy luật nhân lên của virus Parvo trên môi trường tế bào CRFK. Kết quả được trình bày ở bảng 4.9, 4.10, 4.11, 4.12 và biểu đồ 4.1, 4.2, 4.3, 4.4.
Bảng 4.9. Hiệu giá virus của chủng VNUA-C17 trong và ngoài tế bào theo thời gian
Thời gian
Virus 12hpi 24hpi 36hpi 48hpi 60hpi 72hpi 84hpi 96hpi
Ngoài tế bào VNUA-
C17 0,50 0,83 2,16 3,83 4,16 5,83 5,50 2,83
Trong tế bào VNUA-
Biểu đồ 4.1. Đường biểu diễn sự nhân lên của virus VNUA-C17 Bảng 4.10. Hiệu giá virus của chủng VNUA-C31 trong và ngoài tế bào theo Bảng 4.10. Hiệu giá virus của chủng VNUA-C31 trong và ngoài tế bào theo
thời gian Thời gian
Virus 12hpi 24hpi 36hpi 48hpi 60hpi 72hpi 84hpi 96hpi
Ngoài tế bào VNUA-C31 0,50 1,16 2,83 3,83 4,50 5,16 3,83 2,83
Trong tế bào VNUA-C31 0,83 1,50 2,50 3,50 3,50 2,50 2,16 2,50
Bảng 4.11. Hiệu giá virus của chủng VNUA-C32 trong và ngoài tế bào theo thời gian
Thời gian
Virus 12hpi 24hpi 36hpi 48hpi 60hpi 72hpi 84hpi 96hpi
Ngoài tế bào VNUA-C32 0,50 1,50 2,83 3,50 4,50 5,83 5,16 2,83
Trong tế bào VNUA-C32 0,83 1,83 2,50 3,16 3,83 4,16 3,16 2,83
Biểu đồ 4.3. Đường biểu diễn sự nhân lên của virus VNUA-C32 Bảng 4.12. Hiệu giá virus của chủng VNUA-C35 Bảng 4.12. Hiệu giá virus của chủng VNUA-C35
trong và ngoài tế bào theo thời gian Thời gian
Virus 12hpi 24hpi 36hpi 48hpi 60hpi 72hpi 84hpi 96hpi
Ngoài tế bào VNUA-C35 0,50 1,16 2,50 3,83 4,50 5,50 4,50 2,83
Biểu đồ 4.4. Đường biểu diễn sự nhân lên của virus VNUA-C35
Phân tích đường biểu diễn sự nhân lên và phát triển của 4 chủng virus nghiên cứu VNUA - C17, VNUA - C31, VNUA – C32 và VNUA – C35 được thể hiện qua 4 biểu đồ cho thấy, các chủng virus nghiên cứu xâm nhập và nhân lên nhanh trong tế bào, đạt mức cao nhất tại thời điểm 60-72 giờ sau khi gây nhiễm. Tại thời điểm này, thu virus trong tế bào của từng chủng virus nghiên cứu
đem xác định hiệu giá thấy giá trị log TCID50 của chủng VNUA – C32 đạt tới
4,16; chủng VNUA - C17 và VNUA – C35 đạt 3,83; chủng VNUA - C31 đạt 3,5. Sau đó hàm lượng virus trong tế bào sẽ giảm dần. Đến thời điểm 96 giờ sau gây
nhiễm giá trị log TCID50 còn đạt ở mức 2,5 và 3,83.
Qua 4 biểu đồ, nhận thấy đối với cả 4 chủng virus VNUA - C17, VNUA - C31, VNUA – C32 và VNUA – C35 đều có quy luật nhân lên của virus tương đối giống nhau là hàm lượng virus giải phóng tự do ngoài tế bào nhiều hơn hàm lượng virus ở trong tế bào. Tại thời điểm 72h sau gây nhiễm hàm lượng virus đạt
giá trị cao nhất. Cụ thể: chủng VNUA - C17 giá trị log TCID50 đạt 5,83; chủng
VNUA-C31 đạt 5,16; chủng VNUA - C32 đạt 5,83; chủng VNUA - C35 đạt 5,5. Sau thời điểm 72h hàm lượng virus giải phóng tự do ngoài tế bào sẽ giảm đi và đến thời điểm 96h thì hàm lượng virus trong và ngoài tế bào gần như sấp sỉ nhau
Như vậy sự nhân lên của virus khi nuôi cấy trên môi trường tế bào không phải là một quá trình liên tục. Cả 04 chủng virus phân lập được đều cho kết quả tương đối giống nhau. Sau khi gây nhiễm thì virus sẽ xâm nhập vào trong tế bào và nhân lên trong tế bào đến thời điểm 24h gây nhiễm. Tại thời điểm trước 24h sau gây nhiễm thì hàm lượng virus trong tế bào sẽ cao hơn hàm lượng virus ngoài tế bào. Từ thời điểm 36h sau gây nhiễm, virus đã phá hủy tế bào và giải phóng ra ngoài môi trường nên hàm lượng virus giải phóng ngoài môi trường nhiều hơn trong tế bào. Hàm lượng virus trong tế bào đạt giá trị cao nhất tại thời điểm 60h và ngoài tế bào đạt cao nhất tại thời điểm 72h sau gây nhiễm. Sau thời điểm đạt giá trị cao nhất thì hàm lượng virus cả trong và ngoài tế bào đều có xu hướng giảm dần theo thời gian. Như vậy, qua kết quả phân tích đường cong sinh trưởng của Parvovirus cho thấy thời điểm thu virus đạt hiệu giá cao nhất là thời điểm 72h sau gây nhiễm.
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
1. Đã xác định được 40 chó mắc bệnh bằng phương pháp PCR với các triệu chứng lâm sàng điển hình như: Mệt mỏi giảm hoặc bỏ ăn, đau bụng và chướng bụng, sốt cao, nôn mửa, trường hợp nặng thường bị tiêu chảy ra phân có máu, nôn mửa và tiêu chảy. Bệnh tích đại thể chủ yếu hạch màng treo xuất huyết, ruột sung huyết, xuất huyết, ruột non mỏng, niêm mạc ruột bong tróc.
2. Phân lập 40 mẫu virus Parvo trên dòng tế bào CRFK, kết quả đời thứ 2 có 04 mẫu virus đã gây bệnh tích tế bào là VNUA-C17, VNUA-C31, VNUA-C32, VNUA-C35.
3. Gây nhiễm virus Parvo tại đời thứ 5, thấy virus gây bệnh tích tế bào từ 36 giờ đến 48 giờ sau khi gây nhiễm và phá hủy hoàn toàn tế bào sau 72 giờ đến 84 giờ.
- Kết quả 04 chủng virus Parvo có hiệu giá cao (3,16x105 - 4,83x106
TCID50/25µl), chứng tỏ virus Parvo có khả năng phát triển và nhân lên tốt trên
môi trường tế bào CRFK.
- Phân tích đường cong sinh trưởng của virus Parvo cho thấy hàm lượng virus trong tế bào đạt giá trị cao nhất tại thời điểm 60h-72h (hiệu giá virus logTCID50 đạt 3,50 – 4,16) và ngoài tế bào đạt cao nhất tại thời điểm 72h sau gây nhiễm (hiệu giá virus logTCID50 đạt 5,16 - 5,83), thời điểm thu virus đạt hiệu giá cao nhất là thời điểm 72h sau gây nhiễm.
5.2. KIẾN NGHỊ
1) Tiếp tục nghiên cứu và đánh giá về sự ổn định đặc tính sinh học của 4 chủng virus Parvo phân lập được trên môi trường nuôi cấy CRFK.
2) Tiếp tục thu thập các mẫu chó mắc bệnh Parvovirus trên các giống chó khác, tại các thời điểm và không gian khác nhau để có thể phân lập được nhiều mẫu Parvovirus thực địa phục vụ cho việc sàng lọc, lựa chọn chủng Parvovirus thích hợp cho việc sản xuất kháng thể đơn dòng phục vụ chẩn đoán cũng như chế tạo Kit chẩn đoán nhanh chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu tiếng Việt:
1. Nguyễn Ngọc Hùng (2011). Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của bệnh do virus parvo type 2 gây ra trên chó và ứng dụng phương pháp hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán bệnh, Luận văn Thạc sĩ nông nghiệp chuyên ngành Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
2. Nguyễn Như Pho (2003). "Bệnh Parvovirus và Care trên chó." NXB Nông Nghiệp, Hà Nội.
3. Nguyễn Thị Yến Mai, Trần Ngọc Bích, Nguyễn Phúc Khánh, Keovongphet
Phuthavong và Trần Văn Thanh (2018). Tình hình bệnh viêm ruột do parvovirus trên chó tại các phòng mạch thú y tỉnh Tiền Giang, Đồng Tháp và thành phố Cần Thơ. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 54 (Số chuyên đề: Nông nghiệp). tr.136-142.
4. Phạm Sỹ Lăng và cs. (2006). Kỹ thuật nuôi chó và phòng bệnh cho chó. NXB Lao
động xã hội, Hà Nội.
5. Tô Dung và Xuân Giao (2006). Kỹ thuật nuôi chó mèo và phòng bệnh thường gặp. Nhà xuất bản Lao động xã hội, Hà Nội.
6. Trần Ngọc Bích, Trần Thị Thảo, Nguyễn Thị Yến Mai và Nguyễn Quốc Việt, 2013. Khảo sát tỷ lệ bệnh do Parvovirus trên chó từ 1 đến 6 tháng tuổi ở thành phố Cần Thơ. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. (28). tr.15-20.
7. Vương Đức Chất, Lê Thị Tài (2004), Bệnh thường gặp ở chó mèo và cách phòng
trị. NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
II. Tài liệu tiếng Anh:
1. Allen, R., Pereira, L., Raes, D., and Smith, M. (1998). Guidelines for computing crop water requirements-FAO Irrigation and drainage paper 56, FAO-Food and Agriculture Organisation of the United Nations, Rome (http://www. fao. org/docrep) ARPAV (2000), La caratterizzazione climatica della Regione Veneto, Quaderni per. Geophysics. pp. 156, 178.
2. Amelia Goddard , Andrew L. Leisewitz. Canine virus parvo type 2. Veterinary Clinics of North America 2010.
3. Binn LN, Lazar EC, Eddy GA,. Recover y and characterization of a minute virus of canines. Infect Immun 1970.1(5).pp.503–8.
4. Brandy Tabor. Canine virus parvo type 2. Veterinary Technician, Vetlearn.com 2011. 5. Buonavoglia, C., Martella, V., Pratelli, A., Tempesta, M., Cavalli, A., Buonavoglia
and D.. Carmichael, L. (2001). Evidence for evolution of canine Parvovirus type 2 in Italy. Journal of general Virology. 82(12). pp. 3021-3025.
6. Buonavoglia, D., Cavalli, A., Pratelli, A., Martella, V., Greco, G., Tempesta, M., and Buonavoglia, C.(2000). Antigenic analysis of canine Parvovirus strains isolated in Italy. The new microbiologica. 23(1). pp.93-96.
7. Burtonboy, G., Coignoul, F., Delferriere, N., and Pastoret, P. (1979). Canine hemorrhagic enteritis: detection of viral particles by electron microscopy. Archives of virology. 61(1-2).pp. 1-11.
8. Butler, J. (2004). Undoing gender: routledge.
9. Chollom, S.C., Fyaktu, E.J., Okwori, A.E.J. et al., 2013. Molecular detection of canine parvovirus in Jos, Nigeria. Veterinary Medicine and Animal Health. 5.pp. 57-59. 10. Cságola, A., Varga, S., Lőrincz, M. and Tuboly, T., 2014. Analysis of the full
length VP2 protein of canine parvoviruses circulating in Hungary. Archives of Virology. 159 (9). pp. 2441-2444.
11. Carmichael, L., and Binn, L. (1981). New enteric viruses in the dog. Advances in Veterinary Science and Comparative Medicine (USA).
12. Carmichael, L., Joubert, J., and Pollock, R. (1980). Hemagglutination by canine Parvovirus: serologic studies and diagnostic applications. American journal of veterinary research.41(5).pp. 784-791.
13. Decaro, N., Desario, C., Addie, D. D., Martella, V., Vieira, M. J., Elia, G., Thiry, E. (2007). Molecular epidemiology of canine Parvovirus, Europe. Emerging infectious diseases. 13 (8). pp.1222.
14. Decaro, N., Elia, G., Martella, V., Campolo, M., Desario, C., Camero, M., . . . Narcisi, D. (2006). Characterisation of the canine Parvovirus type 2 variants using minor groove binder probe technology. Journal of virological methods. 133(1).pp. 92-99.
15. Hedger, R. (1968). The isolation and characterization of foot-and-mouth disease virus from clinically normal herds of cattle in Botswana. Journal of Hygiene. 66. (01).pp. 27-36.
16. Johnson, R., and Spradbrow, P. (1979). Isolation from dogs with severe enteritis of a Parvovirus related to feline panleucopaenia virus. Australian Veterinary Journal. 55(3).pp.151-152.
17. Kelly, W. (1978). An enteric disease of dogs resembling feline panleucopaenia. Australian Veterinary Journal. 54(12).pp. 593-593.
18. Kaur, G., Chandra, M., Dwivedi, P. and Sharma, N., 2015. Antigenic typing of canine parvovirus using differential PCR. Virus disease. 25(4). pp.481-487.
19. Martella, V., Cavalli, A., Pratelli, A., Bozzo, G., Camero, M., Buonavoglia, D., Buonavoglia, C. (2004). A canine Parvovirus mutant is spreading in Italy. Journal of Clinical Microbiology. 42(3).pp. 1333-1336.
20. Mochizuki, M., Harasawa, R., and Nakatani, H. (1993). Antigenic and genomic