Phần 3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.5. Phương pháp xác định hiệu giá virus
Trong nghiên cứu về đặc tính sinh học của virus, định lượng virus xác định
TCID50 (50% Tissue Culture Infective Dose) có vai trò quan trọng trong việc xác
định lượng virus cần dùng để gây nhiễm tại MOI thích hợp, đảm bảo việc so sánh đặc tính sinh trưởng của các virus khác nhau một cách khách quan và chính xác.
cần thiết để gây ra 50% CPE (bệnh tích tế bào) cho môi trường tế bào gây nhiễm
virus. Khảo nghiệm về TCID50 được ứng dụng phổ biến trong các nghiên cứu
lâm sàng phải xác định liều gây chết của virus. Khi sử dụng cho nuôi cấy tế bào, các tế bào được ủ với virus để virus gây nhiễm và nhân lên thêm. Sau đó, căn cứ vào tỷ lệ chết của tế bào bị nhiễm virus ở những giếng có độ pha loãng virus
khác nhau mà tính ra lgTCID50. Tế bào CRFK được chuẩn bị trên khay 96 giếng
(2.0×104 tế bào/giếng). Dịch nuôi tế bào được hút bỏ, huyền phù virus được pha
loãng theo cơ số 10 đem ủ trên bề mặt tế bào một lớp của các giếng theo thứ tự đánh dấu trước (25µl/giếng), mỗi độ pha loãng lặp lại 3 lần. Sau 1 giờ ủ, dung dịch duy trì DMEM có chứa 2% FBS được bổ sung vào (100µl/giếng) CPE được
quan sát hàng ngày cho đến ngày thứ 4 sau khi gây nhiễm. TCID50 được xác định
theo phương pháp của Reed-Muench.
Quan sát CPE và đánh giá khả năng gây bệnh tích tế bào của Parvovirus sau khi gây nhiễm tại các thời điểm 12, 24, 36, 48, 60 giờ… bằng kính hiển vi soi ngược. Mức độ CPE được tính theo tỷ lệ phần trăm diện tích có bệnh tích tế bào so với tổng diện tích tế bào trong giếng. CPE đạt 100% khi bệnh tích xuất hiện trên cả bề mặt tế bào nuôi cấy một lớp, 0% khi chưa có bệnh tích tế bào. Từ đó, xác định tương đối mức độ bệnh tích. Chẳng hạn, CPE đạt 25% khi quan sát trong toàn bộ vi trường, bệnh tích tế bào xuất hiện trên ¼ diện tích.
Tiến hành xác định quy luật nhân lên của virus cả bên trong và bên ngoài tế bào sau khi gây nhiễm. Tế bào CRFK sau khi gây nhiễm Parvovirus sẽ được thu riêng rẽ ở bên trong và bên ngoài tế bào theo các thời điểm khác nhau từ khi virus bắt đầu nhân lên trên tế bào cho đến khi virus phá hủy hoàn toàn tế bào, xác định hiệu giá virus tại các thời điểm thu và đường cong sinh trưởng của virus chính là đường biểu diễn sự nhân lên của virus qua các thời điểm khác nhau trên tế bào CRFK