Phần 2 Tổng quan tài liệu
2.2. Ðặc điểm sinh học của parvovirus
2.2.9. Các phương pháp chẩn đoán
Chẩn đoán lâm sàng
Chẩn đoán bệnh trước tiên phải khám lâm sàng, dựa vào các triệu chứng và yếu tố dịch tễ của bệnh: Mức độ gây nhiễm lớn; triệu chứng lâm sàng phần lớn chó nhiễm bệnh có biểu hiện viêm ruột xuất huyết; sốt kéo dài từ khi phát bệnh đến khi chó bị ỉa chảy nặng; nôn mửa, ủ rũ, bỏ ăn; đi ỉa chảy, phân thối những ngày sau đó phân có màu hồng hoặc có lẫn máu tươi, có lẫn cả niêm mạc ruột và chất keo nhầy, mùi tanh rất đặc trưng. Sau đó chó hôn mê, mất nước và sút cân nhanh. Chết do ỉa chảy mất nước, mất cân bằng điện giải, sốc do nội độc tố hoặc nhiễm trùng thứ phát. Tỷ lệ tử vong cao, trên 50%.
Cần chẩn đoán phân biệt với các bệnh gây viêm ruột khác trên chó:
Viêm ruột do Coronavirus: Bệnh lây lan rất rộng nhưng không nguy hiểm nhiều cho chó bệnh, tiêu chảy từ 6 – 14 ngày, con vật mất nước, tỷ lệ tử vong thấp.
Viêm ruột do Rotavirus: Bệnh gây tiêu chảy nhưng cách sinh bệnh chưa được biết một cách rõ ràng.
Viêm ruột trong bệnh Care: Chó bệnh có triệu chứng hô hấp và thần kinh đặc
trưng, thường sốt cao trong nhiều ngày (40 – 410C), viêm phổi, viêm ruột (hiếm khi
có máu tươi), có thể gặp nhiều những nốt sài, mụn mủ ở vùng da ít lông.
Viêm dạ dày ruột trong bệnh do Leptospira gây ra: Tiến trình bệnh xảy ra
nhanh với đặc điểm gây suy thận và nhiễm trùng huyết.
Ngoài ra còn gặp các trường hợp viêm ruột ỉa chảy do ký sinh trùng (cầu trùng trên chó, giun lươn, giun đũa, giun móc...).
Phương pháp mổ khám
Khi virus vào trong cơ thể sẽ theo đường máu tới các cơ quan bộ phận và gây tổn thương các cơ quan đó. Dựa trên cơ sở đó những ca bệnh chết không xác định được nguyên nhân có thể mổ khám quan sát bệnh tích đại thể chẩn đoán bệnh.
Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm
Kỹ thuật PCR để phát hiện DNA của CPV trong các mẫu bệnh phẩm.
Kỹ thuật PCR có ưu điểm cho kết quả nhanh và độ chính xác cao, sẽ tốn ít thời gian để phát hiện hơn so với phương pháp nuôi cấy tế bào.
Phân lập virus
Do virus sống ký sinh nội bào, không tự nhân lên được trên các môi trường nhân tạo chính vì thế khi thực hiện phân lập virus cần tiến hành trên môi trường tế bào sống. Một số dòng tế bào thích hợp cho CPV như CRFK, MDCK tuy nhiên tế bào CRFK là thích hợp nhất cho sự phát triển của virus. Việc phân lập trên môi trường tế bào còn cho phép xác định các đặc tính sinh học của virus.
Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch
Nhuộm hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry – IHC) là phương pháp có độ chính xác cao cho phép phát hiện kháng nguyên tồn tại trong tổ chức. Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên lý là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu và bằng chất chỉ thị màu theo nghiên cứu của Lan và cs. (2006).
Nguyên lý: Phương pháp hóa mô miễn dịch sử dụng phản ứng kháng nguyên - kháng thể đặc hiệu áp dụng cho các mảnh cắt đã chuyển đúc parafin. Các mảnh cắt (của các mẫu bệnh phẩm) sau khi đã khử sạch Parafin được phủ kín kháng thể lên bề mặt. Nếu trong mô bệnh phẩm có kháng nguyên tương ứng với kháng thể, phức hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ hình thành. Phức hợp này được nhận biết nhờ hệ thống khuếch đại tín hiệu bao gồm kháng thể bắc cầu (kháng kháng thể) và hoạt chất nhuộm màu DAB (3,39 diaminobenzidine tetraclorua).
Phương pháp mổ khám và hóa mô miễn dịch sử dụng trong trường hợp con bệnh chết. Phương pháp chẩn đoán lâm sàng, xét nghiệm máu, phương pháp chẩn đoán huyết thanh học sử dụng trong trường hợp con vật còn sống. Mỗi phương pháp đều có ưu nhược điểm riêng. Tuy nhiên việc chẩn đoán lâm sàng, và sử dụng test CPV là không thể thiếu để chẩn đoán bệnh sớm nhằm nâng cao hiệu quả điều trị.
Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm
hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme)
Nguyên lý: Phương pháp ELISA có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng
nguyên hay kháng thể cần phát hiện. Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). Trên thực tế người ta thường dùng test ELISA để chẩn đoán (Vương Đức Chất và Lê Thị Tài 2004).
Lấy mẫu phân để làm phản ứng ELISA: các phương pháp ELISA có thể thực hiện ở ngày đầu tiên của bệnh cho đến 3 hoặc 4 ngày sau đó. Các phương pháp ELISA có thể là âm tính giả nếu chạy quá sớm trong quá trình bệnh.
Chẩn đoán bằng test CPV
Lấy phân của những chó nghi mắc bệnh Parvovirus làm phản ứng nhanh bằng test thử CPV.
Nguyên lý: Thiết bị này dựa vào nguyên lý ELISA để phát hiện kháng nguyên của Parvovirus trên chó từ các mẫu xét nghiệm phân. Hai kháng thể đơn dòng trong thiết bị kết hợp với các khu quyết định kháng nguyên khác nhau của kháng nguyên cần chẩn đoán. Sau khi cho bệnh phẩm thấm vào vị trí đệm celluloze của thiết bị, các kháng nguyên của Parvovirus sẽ di chuyển và kết hợp với hợp chất thể keo màu vàng chứa kháng thể đơn dòng kháng virus, để tạo thành phức hợp “kháng nguyên - kháng thể”. Sau đó, phức hợp này kết hợp với kháng thể đơn dòng kháng Parvovirus khác trong màng nitơ- celluloz của thiết bị, để tạo thành hợp chất kép hoàn chỉnh “kháng thể- kháng nguyên- kháng thể” (theo ELISA sandwich). Kết quả xét nghiệm có thể được biểu lộ qua sự xuất hiện các vạch chữ C và vạch mẫu T do thiết bị sử dụng “Phép sắc ký miễn dịch”.
Hình 2.7. Kit thử nhanh Canine Parvovirus(CPV) Ag
Soi trên kính hiển vi điện tử
Trong trường hợp bệnh cấp tính, virion parvoviral có thể tìm thấy trong phân bằng cách sử dụng soi trực tiếp bằng kính hiển vi điện tử.
Phản ứng HA (haemagglutination)
Nguyên lý: Do trên capxit của virus có một bán kháng nguyên HN (Haemagglutinin Neuraminidaza) có khả năng gắn với thụ thể của hồng cầu làm các hồng cầu dính kết với nhau, rồi sau đó cắt đứt các thụ thể hồng cầu để chúng lại rời nhau ra.
Mục đích: Xác định virus có khả năng gây ngưng kết hồng cầu. Xác định nồng độ virus cao hay thấp. Xác định đơn vị ngưng kết dùng cho phản ứng HI
Thí nghiệm hemaglutination được thực hiện như mô tả của Carmichael et
al.,1980. Các mẫu được pha loãng theo thứ tự trong đĩa đáy-V. Đầu tiên, 50μl
PBS đã được thêm vào mỗi giếng của đĩa. Trong cột đầu tiên, đã thêm 50μl mẫu (huyền phù phân hoặc dịch nuôi cấy tế bào). Mẫu được trộn đều, và 50μl được chuyển sang giếng tiếp theo, cho đến dãy giếng thứ 10 thì loại bỏ 50µl, 2 dãy cuối chỉ có PBS làm đối chứng, tổng thể tích các giếng là 50µl. Thử nghiệm HA được thực hiện bằng hồng cầu lợn (0,5%). Các đĩa được phủ nắp và ủ ở 4-7°C trong 2-4 giờ. Phản ứng dương tính: Hồng cầu ngưng kết nằm rải đều thành mảng ở đáy lỗ. Khi đó hiệu giá ngưng kết là độ pha loãng virus lớn nhất mà tại
đó vẫn có hiện tượng ngưng kết hồng cầu rõ. Phản ứng âm tính là khi hồng cầu lắng xuống đáy thành một cục màu đỏ, nước bên trên trong.
Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI (haemagglutination inhibition)
Nguyên lý : Kháng thể đặc hiệu với virus có trong huyết thanh, gặp kháng nguyên tương ứng, phản ứng trung hoà xảy ra. Virus bị kháng thể trung hoà, không còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu.Phản ứng HI (haemagglutination inhibition) cũng được sử dụng để phát hiện ra CPV. Kháng thể có thể phát hiện bởi HI sau khi bị nhiễm bệnh vào ngày thứ 3 hoặc 4.
Kháng thể CPV cũng được xác định bằng cách sử dụng xét nghiệm HI, như
mô tả bởi (Carmichael L. et al., 1980; Moraillon R. et al., 1993). Tất cả các xét
nghiệm được thực hiện ở 4°C sử dụng 1% hồng cầu lợn và 8HAU của CPV. Huyết thanh được xử lý trước với kaolin và hồng cầu lợn để loại bỏ nếu không đặc hiệu. Huyết thanh được pha loãng trong dung dịch muối đệm phosphate (pH = 7,2), bắt đầu bằng pha loãng 1:10. Các màng được biểu hiện bằng sự nghịch đảo của độ pha loãng huyết thanh cao nhất đã ức chế hoàn toàn sự ngưng kết máu. Huyết thanh có độ nhiễm HI từ 1:80 trở lên được xem là dương tính với CPV, và những huyết thanh có độ âm HI dưới 1:40 được coi là âm tính với CPV.