Phần 3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.2. Thời gian nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 9/2018 tới tháng 9/2019.
3.3. ĐỐI TƯỢNG/VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.3.1. Đối tượng nghiên cứu
- Parvovirus gây bệnh viêm ruột tiêu chảy cho chó - Chó mắc bệnh Parvovirus tại một số tỉnh phía Bắc
3.3.2. Vật liệu nghiên cứu
- Dụng cụ, trang thiết bị:
+ Dụng cụ: panh, kéo, kẹp, bông cồn, seringer, ống đựng mẫu, ống eppendorf, quần áo bảo hộ, khẩu trang, bông cồn, dao mổ, bình nuôi cấy tế bào, khay nuôi cấy tế bào 24 giếng...
+ Trang thiết bị:tủ lạnh -200C và -800C, cân phân tích, máy spin, vortex,
máy lắc ấm, máy gia nhiệt PCR, máy điện di, máy chụp ảnh gel, tủ ấm CO2,... - Hóa chất dùng trong nghiên cứu:
+ Hoá chất sử dụng tách chiết DNA tổng số Kit QIAamp (Qiagen, Đức); kit chạy phản ứng PCR theo bộ Kit Promega (M-7212). Cặp mồi được sử dụng trong
nghiên cứu để nhân đoạn gen VP2 bao gồm mồi xuôi (Forward primer) forc: 5'-
AAAGAGAGCCAGGAGAGGTA -3' và mồi ngược (Reverse primer) revc: 5'-
TTCTGACAGCAGGTTGACCA -3'; DW2; TBE; Ethidium bromide, agarose, DNA Marker (Bionexus – Mỹ).
+ Hóa chất phân lập virus: Dòng tế bào CRFK, DMEM, FBS, kháng sinh, kháng nấm...
- Test kit nhanh và kit cho PCR được sử dụng là hãng: promega với độ nhạy là > 99% và độ đặc hiệu là > 98%, thời gian khảo nghiệm là 5-10 phút.
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.4.1. Thu thập mẫu chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus 3.4.2. Nghiên cứu phân lập Parvovirus trên môi trường tế bào CRFK 3.4.2. Nghiên cứu phân lập Parvovirus trên môi trường tế bào CRFK
3.4.3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của những chủng parvovirus phân lập được phân lập được
- Khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) của Parvovirus trên môi trường tế bào CRFK.
- Xác định hiệu giá Parvovirus trên môi trường tế bào CRFK.
- Xác định đương cong sinh trưởng của những chủng Parvovirus trên môi trường tế bào CRFK.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Phương pháp mổ khám 3.5.1. Phương pháp mổ khám
Chó mắc bệnh được cố định trên bàn mổ hoặc khay mổ, được mổ khám theo quy trình như sau:
- Mổ khám xoang ngực: Trước tiên lột bỏ hết cơ ngực, sau đó dùng kéo cắt xương cắt một đường bắt đầu từ đầu dưới xương sườn thứ nhất đến đầu dưới của xương sườn cuối cùng, rồi cắt rời xương ức ra khỏi cơ hoành, phế mạc giữa và bao tim. Kiểm tra các vị trí và mặt ngoài các cơ quan xoang ngực: trạng thái tim, trạng thái phổi và các bộ phận liên quan đến màng tim và phổi như hạch phổi là chủ yếu.
+ Các khí quan vùng cổ: Rạch một đường thẳng từ mõm đến đến vùng ngực, mở da ra hai bên, kiểm tra niêm mạc dưới da và tuyến giáp trạng, tuyến nước bọt: vị trí, trọng lượng của tuyến…. Kiểm tra hạch dưới hàm. Dùng tay và dao rạch từ từ lấy lưỡi ra ngoài kiểm tra lưỡi, hạch amidal, hầu và thực quản,…
- Mổ khám xoang bụng: Rạch một đường thẳng bên trái từ mỏm xương kiếm xuống đến sát hậu môn. Cắt từng lớp da ở bụng và các tổ chức liên kết ra. Nếu bụng chướng to thì phải lấy ngón tay hoặc vật cùn làm thủng màng bụng, luồn ngửa hai ngón tay trỏ và ngón giữa của tay trái vào xoang bụng, tay phải cầm ngửa lưỡi dao luồn vào kẽ hai ngón tay trái đó rồi vạch vách màng bụng theo hướng từ trên xuống dưới. như vậy tránh được làm rách dạ dày và ruột. Kiểm tra các cơ quan ở xoang bụng: lách, gan, dạ dày, ruột, thận và tuyến thượng thận...
+ Các cơ quan vùng xoang chậu: Cơ quan sinh dục đực: bao dịch hoàn, âm nang, qui đầu, niệu đạo… Khí quan sinh dục cái: tương mạc từ cung, màng cheo và tổ chức liên kết xung quanh niệu quản, lâm ba quản và hoạch lâm ba. Mổ tử cung và âm đạo để quan sát màu sắc, độ rắn, lở loét, sẹo…Bàng quang (bóng đái): trạng thái tương mạc, số lượng và tính chất của chất chứa bên trong, trạng thái niêm mạc bàng quang. Trực tràng: kiểm tra tương mạc, niêm mạc và trạng thái phân bên trong
- Mổ kiểm tra hộp sọ và não: Cố định đầu con vật rồi lột da và cơ vùng trán rồi cưa một đường ngang sau lồi xương đỉnh, sau đó từ hai bên xương đỉnh men theo xương thái dương hai bên tới giáp phần dưới mũi. Lấy dao nạy xương sọ theo các đường cắt để bộc lộ não. Dùng ngón tay luồn dưới não nhẹ nhàng nâng não lên, dùng chuôi dao luồn xuống dưới bẩy nhẹ não lên đế lấy cho dễ. Sau đó luồn kéo cắt đứt các dây thần kinh khác.
3.5.2. Phương pháp tách chiết DNA
* Tách chiết DNA virus bằng Kit QIAgen
Bước 1: Dùng pipet hút 20µl Proteinase K vào ống eppendorf 1,5ml, thêm 100 µl mẫu và cho thêm PBS cho đủ 220 µl. Để bất hoạt RNA trong phản ứng thì bổ sung thêm 4µl RNase A (100mg/ml), ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút.
Bước 2: Cho 200 µl đệm Buffer AL và trộn đều bằng vortex trong 15 giây.
Ủ ở 560C trong 10 phút.
Bước 3: Thêm 200µl ethanol (100%), trộn bằng máy vortex trong 15 giây.
Bước 4: Chuyển phần dịch pha trộn từ bước 3 trên vào cột DNeasy Mini spin, ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới.
Bước 5: Đặt cột vào ống 2ml sạch mới. Cẩn thận mở nắp cột DNeasy Mini spin, thêm 500µl Buffer AW1 không để rơi lên thành, miệng, đóng nắp và ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới.
Bước 6: Đặt cột vào ống 2ml sạch mới. Cẩn thận mở nắp cột DNeasy Mini spin, thêm 500µl Buffer AW2 và ly tâm 14.000 vòng/phút trong 3 phút và loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới.
Bước 7: Đặt cột DNeasy Mini spin sang ống 1,5 ml mới và loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới. Thêm 200 µl đệm AE trực tiếp lên màng DNeasy. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút và ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút rồi bỏ cột, giữ nước dưới.
Dịch lỏng bên dưới chính là dung dịch chứa DNA tổng số.Cuối cùng ký
hiệu mẫu và bảo quản mẫu ở -200C hoặc -700C
3.5.3. Phương pháp PCR
+ Mẫu DNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần được trình bày ở bảng sau: Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (μl) Go Green 25 Mẫu DNA 5 Primer Forwad 1 Primer Reverse 1
Nước khử ion (DEPC – treated) 18
Tổng thể tích 50
+ Nghiên cứu sử dụng cặp mồi để chẩn đoán định tính Parvovirus
forc/revc (Seon Ah Park et al., 2012). Thông tin chi tiết về cặp mồi được trình
bày ở bảng sau:
Tên mồi Trình tự nucleotid Kích thước sản phẩm
Mồi xuôi 5'- AAAGAGAGCCAGGAGAGGTA -3'
550 bp
Mồi ngược 5'- TTCTGACAGCAGGTTGACCA -3'
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
1 Duỗi mạch 94 5 phút 1
2
Duỗi mạch 94 40 giây
40
Gắn mồi 57 40 giây
Tổng hợp sợi mới 72 50 giây
3 Hoàn chỉnh 72 5 phút 1
4 Giữ sản phẩm 4 ∞
+ Điện di trên gel agarose đọc kết quả.
3.5.4. Phương pháp phân lập Parvovirus
Bước 1:
Tế bào CRFK được đưa vào nuôi cấy trong môi trường và điều kiện thích hợp, môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) có bổ sung 10%
FBS (Fetal bovine serum) làm ấm trong tủ 37oC trong 30 phút trước khi lấy tế
bào mọc vừa kín đáy giếng khay 24 thì tiến hành gây nhiễm virus.
Bước 2:
Chuẩn bị mẫu phân lập: Mẫu bệnh phẩm được nghiền nát bằng chày và cối vô trùng sau đó được đồng nhất trong dung dịch DMEM có bổ sung 10% kháng sinh. Ly tâm tốc độ cao thu lại hỗn dịch. Hỗn dịch đồng nhất qua lọc được lấy để gây nhiễm vào tế bào CRFK.
Bước 3:
Gây nhiễm virus và quan sát kết quả: Từ các khay 24 giếng tế bào đã chuẩn bị ở bước một hút bỏ môi trường nuôi cấy và bổ sung 100µl mẫu phân lập đã
chuẩn bị ở bước hai ủ trong thời gian 60 phút/370C/5%CO2 sau đó loại bỏ dung
dịch và bổ sung 1ml môi trường phân lập gồm (DMEM có chứa 2% FBS, 2%
kháng sinh) vào mỗi giếng và nuôi ở 370C với 5% CO2. Hàng ngày theo dõi sự
phá huỷ tế bào bằng kính hiển vi soi nổi và thu lại virus khi tế bào bị phá hủy đạt 80% - 90%. Nếu không thấy xuất hiện bệnh tích thì thu lại virus sau 96 giờ gây nhiễm và gây nhiễm lại lần nữa để kiểm tra bệnh tích.
Sau 96h gây nhiễm của đời thứ nhất, khay tế bào được cất ở -800C, sau đó
đông tan ba lần, ly tâm loại bỏ cặn tế bào. Dịch nổi tiếp tục được gây nhiễm vào khay tế bào CRFK mới và quan sát bệnh tích trong vòng 96h. Kết quả sau khi gây nhiễm đời thứ 2 có 04 mẫu virus đã gây bệnh tích tế bào. Thông tin các chủng virus thu được ở đời thứ hai được trình bày tại bảng 4.6. Đối với các mẫu virus không gây bệnh tích tế bào ở đời gây nhiễm thứ hai sẽ tiếp tục gây nhiễm đời thứ ba để quan sát bệnh tích tế bào. Kết quả cho thấy tất cả các mẫu còn lại đều không gây bệnh tích tại đời thứ 3. Thông thường, nếu CPE âm tính sau 3 đời, kết quả phân lập virus đã được coi là âm tính (Hedger, 1968).
3.5.5. Phương pháp xác định hiệu giá virus
Trong nghiên cứu về đặc tính sinh học của virus, định lượng virus xác định
TCID50 (50% Tissue Culture Infective Dose) có vai trò quan trọng trong việc xác
định lượng virus cần dùng để gây nhiễm tại MOI thích hợp, đảm bảo việc so sánh đặc tính sinh trưởng của các virus khác nhau một cách khách quan và chính xác.
cần thiết để gây ra 50% CPE (bệnh tích tế bào) cho môi trường tế bào gây nhiễm
virus. Khảo nghiệm về TCID50 được ứng dụng phổ biến trong các nghiên cứu
lâm sàng phải xác định liều gây chết của virus. Khi sử dụng cho nuôi cấy tế bào, các tế bào được ủ với virus để virus gây nhiễm và nhân lên thêm. Sau đó, căn cứ vào tỷ lệ chết của tế bào bị nhiễm virus ở những giếng có độ pha loãng virus
khác nhau mà tính ra lgTCID50. Tế bào CRFK được chuẩn bị trên khay 96 giếng
(2.0×104 tế bào/giếng). Dịch nuôi tế bào được hút bỏ, huyền phù virus được pha
loãng theo cơ số 10 đem ủ trên bề mặt tế bào một lớp của các giếng theo thứ tự đánh dấu trước (25µl/giếng), mỗi độ pha loãng lặp lại 3 lần. Sau 1 giờ ủ, dung dịch duy trì DMEM có chứa 2% FBS được bổ sung vào (100µl/giếng) CPE được
quan sát hàng ngày cho đến ngày thứ 4 sau khi gây nhiễm. TCID50 được xác định
theo phương pháp của Reed-Muench.
Quan sát CPE và đánh giá khả năng gây bệnh tích tế bào của Parvovirus sau khi gây nhiễm tại các thời điểm 12, 24, 36, 48, 60 giờ… bằng kính hiển vi soi ngược. Mức độ CPE được tính theo tỷ lệ phần trăm diện tích có bệnh tích tế bào so với tổng diện tích tế bào trong giếng. CPE đạt 100% khi bệnh tích xuất hiện trên cả bề mặt tế bào nuôi cấy một lớp, 0% khi chưa có bệnh tích tế bào. Từ đó, xác định tương đối mức độ bệnh tích. Chẳng hạn, CPE đạt 25% khi quan sát trong toàn bộ vi trường, bệnh tích tế bào xuất hiện trên ¼ diện tích.
Tiến hành xác định quy luật nhân lên của virus cả bên trong và bên ngoài tế bào sau khi gây nhiễm. Tế bào CRFK sau khi gây nhiễm Parvovirus sẽ được thu riêng rẽ ở bên trong và bên ngoài tế bào theo các thời điểm khác nhau từ khi virus bắt đầu nhân lên trên tế bào cho đến khi virus phá hủy hoàn toàn tế bào, xác định hiệu giá virus tại các thời điểm thu và đường cong sinh trưởng của virus chính là đường biểu diễn sự nhân lên của virus qua các thời điểm khác nhau trên tế bào CRFK
3.5.6. Xử lý số liệu
Các số liệu thu thập được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học và phần mềm Excel 2010.
3.5.7. Phương pháp test kit xét nghiệm nhanh bệnh parvovirus trên chó
+ Nguyên lý:
Thiết bị này dựa vào nguyên lý ELISA để phát hiện kháng nguyên (KN) của virus Parvo trên chó từ các mẫu phân xét nghiệm. Hai kháng thể (KT) đơn dòng
chuyên biệt từ bộ kit kết hợp với các điểm quyết định kháng nguyên khác nhau của kháng nguyên cần chẩn đoán (Parvovirus có trong phân). Sau khi cho bệnh
phẩm thấm vào vị trí đệm xenlulôz của thiết bị, các kháng nguyên của virus
Parvo sẽ di chuyển và kết hợp với hợp chất thể keo màu vàng chứa kháng thể đơn dòng có gắn ‘conjugat’ kháng virus Parvo, để tạo thành phức hợp ‘Kháng nguyên - Kháng thể’ (KT-KN). Sau đó, phức hợp này kết hợp với kháng thể đơn dòng kháng virus Parvo khác trong màng nitơ-xenlulôz của thiết bị, để tạo thành
hợp chất kẹp (sandwich) hoàn chỉnh ‘KT-KN-KT’ (theo ELISA sandwich). Kết
quả xét nghiệm có thể được biểu lộ qua sự xuất hiện các vạch C và T theo
nguyên lý của ‘phép sắc ký miễn dịch’ [immunochromatography].
+ Đặc tính:
- Chỉ cần một công đoạn xét nghiệm nhanh để phát hiện kháng nguyên của
virus Parvo trên chó.
- Cho kết quả nhanh trong vòng 5-10 phút. - Không cần sử dụng thiết bị đắt tiền. - Dễ dự trữ và bảo quản.
- Các nguyên liệu dùng trong bộ kit xét nghiệm có độ tinh khiết và chất
lượng cao, làm tăng độ nhạy và độ chuyên biệt.
+ Vật liệu: Một hộp 10 test
- Thiết bị xét nghiệm 10 đơn vị - Chất pha loãng (dung dịch đệm) 1ml x 10 đơn vị
- Ống nhỏ giọt 10 đơn vị
- Que lấy bệnh phẩm 10 đơn vị + Thành phần:
Thiết bị xét nghiệm có đánh dấu vùng S (vị trí nhỏ giọt), vạch kết quả xét
nghiệm T [Test line] và vạch chứng C [Control test]. Thiết bị này gồm các thành
phần như chất đệm mẫu [sample pad], chất đệm conjugat [conjugate pad], màng
nitơ-cellulôz (giấy xét nghiệm [test paper]) và chất đệm hấp thu [absorbant pad].
+ Tác dụng:Phát hiện kháng nguyên virus Parvo trên chó từ các mẫu phân.
1 Mẫu xét nghiệm: Phân của chó nghi bệnh Parvo. 2 Cách bảo quản mẫu bệnh phẩm:
+ Bảo quản mẫu ở 2 - 80 C trong vòng 24 giờ.
+ Giữ mẫu ở nhiệt độ 22-250 C trước khi sử dụng.
3 Thao tác xét nghiệm:
+ Lấy mẫu phân bằng một que lấy bệnh phẩm và đưa que vào lọ chứa 1ml chất pha loãng.
+ Khuấy động xoay tròn que trong chất pha loãng. + Lấy mẫu phân pha loảng với 1 ống nhỏ giọt.
+ Nhỏ 3-4 giọt mẫu vào vùng S của thiết bị xét nghiệm.
+ Đọc kết quả xét nghiệm trong vòng 5-10 phút. Kết quả âm tính cần xem xét sau 10 phút.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ THU THẬP MẪU CHÓ MẮC PARVOVIRUS
Trong thời gian thực hiện đề tài tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y, đã tiến hành thu thập mẫu chó mắc Parvovirus tại các phòng khám chó mèo một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. Kết quả thu thập được trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Thông tin mẫu thu thập chó mắc Parvovirus trong thời gian nghiên cứu nghiên cứu
Stt Địa chỉ Số
lượng Test kit nhanh CPV
1 Phòng khám Petheath
(Đình Bảng- Từ Sơn- Bắc Ninh) 15 15/15 Dương tính
2 Phòng khám Thú y cộng đồng
(Gia Lâm- Hà Nội) 14 14/14 Dương tính
3 Phòng khám Funpet- Thành phố Hải Dương 11 11/11 Dương tính
Tổng chung 40
Qua bảng 4.1 cho biết, chúng tôi đã thu thập được tổng số 40 mẫu chó
mắc Parvovirus tại các địa điểm phòng khám Hà Nội, Bắc Ninh và Hải
Dương. Cả 40 con chó được tiến hành test nhanh kit CPV, bước đầu cho thấy cả 40 con chó đều dương tính với Parvovirus. Để khẳng định cả 40 con chó đều mắc viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus, chúng tôi tiến hành lấy mẫu làm phản ứng PCR.
Sản phẩm DNA của virus thu được sau khi tách chiết từ bệnh phẩm bằng kit tách chiết Qiagen sẽ được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR. Sản phẩm sau khi khuếch đại được điện di và chụp ảnh. Kết quả của phản ứng PCR xác định Parvovirus được