Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.2. Kết quả phân lập virus trên môi trường tế bào CRFK
4.2.1. Kết quả phân lập Parvovirus
Tiến hành phân lập 40 mẫu bệnh phẩm thu được từ những con chó có biểu hiện triệu chứng lâm sàng, bệnh tích điển hình và có kết quả PCR dương tính với Parvovirus. Trên môi trường tế bào CRFK, đây là dòng tế bào thích hợp cho sự nhân lên của Parvovirus. Các mẫu bệnh phẩm được xử lý và gây nhiễm lặp lại 2 lần trên khay 24 giếng tế bào đã được chuẩn bị sẵn, với thể tích 300µl huyễn dịch trên 1 giếng, sau đó quan sát bệnh tích trong vòng 96h. Kết quả phân lập Parvo virus trên môi trường CRFK trình bày ở bảng 4.5.
Bảng 4.5. Kết quả phân lập Parvovirus trên môi trường CRFK Số chủng virus Số chủng virus gây nhiễm Lần cấy chuyển Số chủng xuất hiện bệnh tích tế bào Biểu hiện bệnh tích tế bào 40 1 0 Không có 40 2 4 Tế bào CRFK bị phá hủy, bong tróc khỏi bề mặt nuôi cấy
40 3 4
Tế bào CRFK bị phá hủy, bong tróc khỏi bề mặt nuôi cấy
Qua bảng 4.5. cho thấy tại đời gây nhiễm thứ nhất không có chủng virus nào gây bệnh tích tế bào (hình 4.2 ). Kết quả sau khi gây nhiễm đời thứ 2 có 04 mẫu virus đã gây bệnh tích tế bào. Thông tin các chủng virus thu được ở đời thứ hai được trình bày tại bảng 4.6. Tiếp tục gây nhiễm đời thứ ba để quan sát bệnh tích tế bào. Kết quả cho thấy tất cả các mẫu còn lại đều không gây bệnh tích tại đời thứ 3. Như vậy, sau đợt gây nhiễm thứ 3 nghiên cứu đã có 04 chủng Parvovirus phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm.
a.Tế bào 24h b) Tế bào 48h c) Tế bào 72h d) Tế bào 96h
Bảng 4.6. Thông tin các chủng Parvovirus gây bệnh tích tế bào trên môi trường CRFK STT Tên mẫu Giống Tháng tuổi Tính biệt
Địa điểm lấy mẫu
Tên chủng virus
1 C17 Becgie Bỉ 5 Cái Hà Nội VNUA-C17
2 C31 Bắc Kinh Lai Nhật 4 Đực Hải Dương VNUA-C31
3 C32 Chó Ta 4 Đực Hải Dương VNUA-C32
4 C35 Poodle 9 Đực Bắc Ninh VNUA-C35
Hình 4.3. Tế bào CRFK bình thường Hình 4.4. Bệnh tích tế bào do Parvovirus gây ra Parvovirus gây ra
4.2.2. Kết quả kiểm tra sự có mặt của virus trong mẫu phân lập bằng phương pháp PCR
Sau khi thu được 4 chủng Parvovirus gây bệnh tích tế bào đặc trưng trên môi trường tế bào CRFK và sau đó dịch virus ở đời thứ 3 được lựa chọn để kiểm tra sự có mặt của Parvovirus. Dịch virus được thu lại và kiểm tra bằng phương pháp PCR một lần nữa để giám định lại sự phát triển và nhân lên của virus và khẳng định sự biến đổi của tế bào CRFK quan sát được là do Parvovirus gây nên,
mà không phải do nguyên nhân khác như sai sót trong khâu chuẩn bị, hoặc bệnh tích được gây ra bởi 1 virus khác.
Dịch virus thu được sau phân lập trên tế bào CRFK được lấy ra để tiến hành tách chiết DNA theo hướng dẫn của kit hãng Qiagen. Phản ứng PCR được thực hiện (theo các bước đã trình bày trong phần 3.4.3) với cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di kiểm tra. Kết quả cho thấy mẫu đối chứng âm (N) âm tính, tại giếng đối chứng dương (P) và giếng biểu thị kết quả của các mẫu. Xuất hiện một băng sáng nét, kích thước 550bp theo đúng thiết kế. Như vậy có thể khẳng định bệnh tích trên tế bào và virus phân lập được là Parvovirus.
Trên thế giới, nghiên cứu phân lập Parvovirus trên dòng tế bào CRFK
(Crandell Feline Kidney) được sử dụng trong nhiều quốc gia (Mochizuki M et
al. 1996; Parthiban S et al., 2011). Cho đến thời điểm hiện tại, kết quả nghiên
cứu của chúng tôi thực hiện phân lập thành công Parvovirus trên dòng tế bào một lớp CRFK là đầu tiên tại Việt Nam. Từ đó, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu các đặc tính sinh học của Parvovirus trên môi trường tế bào CRFK.