Phần 2 Tổng quan tài liệu
2.3. Tổng quan về nuôi cấy tế bào
Nuôi cấy tế bào là kĩ thuật duy trì và phát triển các tế bào ở ngoài cơ thể sống nhưng vẫn thực hiện đầy đủ các chức năng biến dưỡng và chức năng chuyên biệt của tế bào. Quá trình nuôi cấy tế bào cho phép mỗi tế bào đóng vai trò như những tế bào độc lập, nó có thể phân chia nhờ quá trình nguyên phân và quần thể tế bào tiếp tục phát triển cho đến khi bị giới hạn bởi bề mặt nuôi cấy hay sự cạn kiệt dinh dưỡng. Kĩ thuật nuôi cấy tế bào được tiến hành lần đầu tiên vào năm 1907 bởi Harrison. Ngày nay kĩ thuật này đã được ứng dụng rộng rãi trong y học và thú y để nghiên cứu sự tác động của các chất lên tế bào hay nghiên cứu virus để phân lập, giám định, chuẩn độ virus, xác định tính chất huyết thanh học, quan sát hình thái siêu cấu trúc của virus và đặc biệt là sản xuất vacxin. Quá trình nuôi cấy tế bảo thường gồm những tế bào thuộc cùng một loại.
2.3.1. Một số đặc điểm của tế bào động vật
Tính cơ học yếu: tế bào động vật không vách và kích thước tế bào khá lớn (khoảng 10μm) nên tính bền cơ học yếu. Do đó, khi nuôi cấy, tế bào động vật rất dễ vỡ do các lực tác động khi thao tác trên tế bào như khuấy trộn để tách tế bào,
di chuyển mẫu tế bào.
Tăng trưởng và phân chia chậm: thời gian tăng trưởng gấp đôi của tế bào trung bình là 30 giờ. Trong khi đó thời gian này của vi khuẩn chỉ khoảng 30 phút. Tính cần giá đỡ: hầu hết tế bào động vật cần bám vào giá đỡ để có thể sống và phân chia. Thông thường, tế bào phát triển tốt khi gắn vào bề mặt rắn. Tuy vậy một số tế bào như tế bào ung thư có thể sinh trưởng và phân chia ở trạng thái lơ lửng không cần giá đỡ.
Tế bào động vật có thể được bảo quản trong Nitơ lỏng ở nhiệt độ -196⁰C, ở
nhiệt độ này tế bào có thể giữ được khả năng sống không hạn định và sẽ phát triển trở lại trên môi trường nuôi cấy khi phục hồi.
Ngoài ra tế bào còn có các đặc tính khác như: kém thích nghi với môi trường, nhạy cảm với các ion kim loại và đa số tế bào động vật cần huyết thanh, hormone tăng trưởng để phân chia.
2.3.2. Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy tế bào
Môi trường nuôi cấy tế bào phức tạp và giàu chất dinh dưỡng để tạo điều kiện tốt nhất cho sự phát triển của tế bào. Môi trường có thể được cung cấp dưới dạng dung dịch để sử dụng ngay hay dưới dạng dung dịch đậm đặc hoặc dạng bột. Dạng dung dịch đậm đặc có thể sử dụng sau khi pha loãng với nước cất tiệt trùng, trong khi dạng bột phải được hòa tan trong nước và tiệt trùng bằng cách lọc qua lưới lọc 0,22μm.
Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy:
Carbonhydrate: glucose (5-10mM) được dùng trong hầu hết các công thức để cung cấp nguồn năng lượng cũng như tiền chất cho tổng hợp sinh học, như ribose cần cho tổng hợp acid nucleic. Có thể dùng fructose thay thế cho glucose. Glucose có trong hầu hết môi trường là nguồn ly giải tạo pyruvate vào chu trình
acid citric và sinh ra CO2.
Amino acid (0,1- 0,2mM) cũng được dùng như là nguồn tiền chất cho tổng hợp protein. Người ta thường dùng glutamine, tuy nhiên, ammoniac được thành lập từ chuyển hóa glutamine có thể ức chế sinh trưởng trong một số quá trình nuôi cấy.
Muối cũng được dùng để làm cho môi trường nuôi cấy có tính đẳng trương, duy trì sự cân bằng với phần bên trong tế bào.
Bicarbonate (NaHCO3) cũng được dùng để đóng vai trò như hệ thống đệm
trong sự kết hợp với 5-10% CO2 được cung cấp bởi tủ ủ. Điều này cho phép môi
trường duy trì có pH từ 7,2-7,4.
Vitamin và hormone hiện diện ở nồng độ tương đối thấp và được dùng để kích thích sinh trưởng. Lượng vitamin và hormone thay đổi nhiều giữa các công thức môi trường khác nhau. Điều này cho thấy nhu cầu vitamin của các dòng tế bào là khác nhau.
Huyết thanh: được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để cải thiện sự sinh trưởng của tế bào, giúp tế bào dễ bám vào bề mặt giá đỡ và phát triển mạnh hơn. Huyết thanh thai bò (Fetal Bovine Serum- FBS) thường được sử dụng bổ sung vào cho môi trường nuôi cấy, nhưng lại đắt tiền và hiếm. Nồng độ huyết thanh thường được dùng từ 5- 20%. Những dòng tế bào liên tục có xu hướng thích nghi với môi trường có nồng độ huyết thanh thấp. Xu hướng hiện nay là sử dụng môi trường không huyết thanh nhưng chỉ mới thành công trong nuôi cấy tế bào Hela và L292. Các protein trong huyết thanh như albuminm fibronectin, globulin giúp tế bào bám dính và phát triển.
Những bất lợi của môi trường huyết thanh:
+ Thay đổi huyết thanh cần làm nhiều xét nghiệm nên tốn kém + Khi cấy nhiều loại tế bào cần nhiều loại huyết thanh
+ Nguy cơ lan truyền mầm bệnh
+ Huyết thanh thường nhiễm virus và Mycoplasma, do đó ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy
+ Giá thành đắt
Những bất lợi của môi trường không có huyết thanh
+ Tế bào phát triển và phân chia chậm
+ Môi trường được pha chế sẵn, khó kiểm tra chất lượng và đắt tiền
Kháng sinh thường được cho vào môi trường nuôi cấy trong thời gian ngắn nhằm làm giảm nguy cơ tạp nhiễm. Nồng độ tối ưu của kháng sinh được xác định theo kinh nghiệm của người tiến hành nuôi cấy. Kháng sinh thường được dùng dưới dạng kết hợp. Có thể sử dụng Penicillin G, Streptomycin và Amphotericin B để ức chế sự phát triển của vi khuẩn Gram dương, Gram âm và chống nấm (Butler, J., 2004).
2.3.3. Điều kiện nuôi cấy
pH = 7,4. Nếu ở nhiệt độ thấp hơn một chút so với 37oC thì tốc độ sinh trưởng sẽ giảm xuống nhưng tế bào không bị phá hủy. Tuy nhiên nhiệt độ cao hơn, từ 39-
40oC sẽ phá hủy tế bào. Do vậy, việc đảm bảo rằng nhiệt độ không tăng trong tủ
cấy là rất quan trọng (Butler J., 2004).
2.3.4. Sự tạp nhiễm và cách hạn chế
Nguyên nhân chính của sự thất bại trong nuôi cấy tế bào là bị tạp nhiễm. Sự tạp nhiễm thường do tiệt trùng dụng cụ không đạt yêu cầu và thường bắt nguồn từ sự tiếp xúc của con người như là bàn tay, hơi thở, tóc. Môi trường và thiết bị ngày nay được cung cấp nhằm hạn chế tới mức tối đa những nguy cơ tạp nhiễm này. Nguy cơ này cũng có thể được giảm bớt hơn nữa bởi sự quan tâm cẩn thận đến từng chi tiết khi tiến hành nuôi cấy. Nhằm giảm bớt các nguồn tạp nhiễm, cần chú ý các điểm sau:
Rửa tay với xà phòng diệt khuẩn trước và sau quá trình nuôi cấy có thể
làm giảm lượng vi khuẩn gây hại, có thể dùng găng tay y tế
Hạn chế những người tới phòng thí nghiệm khi thí nghiệm đang tiến hành
Làm sạch bề mặt làm việc trước và sau mỗi quá trình nuôi cấy
Dùng không gian tiệt trùng (ví dụ tủ cấy tiệt trùng) cho tất cả các thao tác
Dùng chai nuôi cấy bằng plastic được tiệt trùng và chỉ dùng một lần
Mua môi trường và huyết thanh từ nhà cung cấp đáng tin cậy để đảm
bảo rằng sự tạp nhiễm không phát sinh từ nguồn này (Butler J., 2004)