Phần 3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.4. Phương pháp phân lập Parvovirus
Bước 1:
Tế bào CRFK được đưa vào nuôi cấy trong môi trường và điều kiện thích hợp, môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) có bổ sung 10%
FBS (Fetal bovine serum) làm ấm trong tủ 37oC trong 30 phút trước khi lấy tế
bào mọc vừa kín đáy giếng khay 24 thì tiến hành gây nhiễm virus.
Bước 2:
Chuẩn bị mẫu phân lập: Mẫu bệnh phẩm được nghiền nát bằng chày và cối vô trùng sau đó được đồng nhất trong dung dịch DMEM có bổ sung 10% kháng sinh. Ly tâm tốc độ cao thu lại hỗn dịch. Hỗn dịch đồng nhất qua lọc được lấy để gây nhiễm vào tế bào CRFK.
Bước 3:
Gây nhiễm virus và quan sát kết quả: Từ các khay 24 giếng tế bào đã chuẩn bị ở bước một hút bỏ môi trường nuôi cấy và bổ sung 100µl mẫu phân lập đã
chuẩn bị ở bước hai ủ trong thời gian 60 phút/370C/5%CO2 sau đó loại bỏ dung
dịch và bổ sung 1ml môi trường phân lập gồm (DMEM có chứa 2% FBS, 2%
kháng sinh) vào mỗi giếng và nuôi ở 370C với 5% CO2. Hàng ngày theo dõi sự
phá huỷ tế bào bằng kính hiển vi soi nổi và thu lại virus khi tế bào bị phá hủy đạt 80% - 90%. Nếu không thấy xuất hiện bệnh tích thì thu lại virus sau 96 giờ gây nhiễm và gây nhiễm lại lần nữa để kiểm tra bệnh tích.
Sau 96h gây nhiễm của đời thứ nhất, khay tế bào được cất ở -800C, sau đó
đông tan ba lần, ly tâm loại bỏ cặn tế bào. Dịch nổi tiếp tục được gây nhiễm vào khay tế bào CRFK mới và quan sát bệnh tích trong vòng 96h. Kết quả sau khi gây nhiễm đời thứ 2 có 04 mẫu virus đã gây bệnh tích tế bào. Thông tin các chủng virus thu được ở đời thứ hai được trình bày tại bảng 4.6. Đối với các mẫu virus không gây bệnh tích tế bào ở đời gây nhiễm thứ hai sẽ tiếp tục gây nhiễm đời thứ ba để quan sát bệnh tích tế bào. Kết quả cho thấy tất cả các mẫu còn lại đều không gây bệnh tích tại đời thứ 3. Thông thường, nếu CPE âm tính sau 3 đời, kết quả phân lập virus đã được coi là âm tính (Hedger, 1968).