Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.1. Kết quả chế tạo vacxin vô hoạt PCV2 thử nghiệm
4.1.1. Kết quả xác định sự có mặt của PCV2 trong giống gốc để chế vacxin
Sử dụng phƣơng pháp PCR đã đƣợc tối ƣu hóa, chúng tôi đã khẳng định lại sự có mặt của PCV2 trong 3 mẫu virus phân lập đƣợc của giống gốc chế tạo vacxin. Kết quả đƣợc trình bày ở hình 4.1.
Hình 4.1. Kết quả PCR xác định PCV2 trong giống gốc để chế vacxin
(03, 04, 07: chủng PCV2; đối chứng âm (-) và đối chứng dương (+))
Hình 4.1 cho thấy, 3 mẫu cho kết quả dƣơng tính mạnh với PCV2 khi sử dụng cặp mồi VF2/VR2 nhân lên khoảng 0,2% bộ gen của PCV2. Sản phẩm PCR nhân lên bởi các mẫu virus đều không xuất hiện các vạch phụ.
4.1.2. Kết quả giám định độ thuần khiết của PCV2
Trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra độ thuần khiết của PCV2 với một số virus và mycoplasma thƣờng lƣu hành ở đàn lợn, có khả năng nhân lên trên tế bào PK15, bao gồm: CSFV, PRRSV, PPV, PEDV, TGEV, PRV, PAdV, PCV1 và MHP. Kết quả đƣợc chúng tôi trình bày ở hình 4.2.
Hình 4.2. Kết quả giám định thuần khiết giống PCV2
(03, 04, 07:chủng PCV2 phân lập được ; đối chứng âm (-) và đối chứng dương (+))
Các mẫu đối chứng dƣơng đều cho vạch đặc hiệu có kích thƣớc nhƣ thiết kế; trong khi đó, đều không quan sát đƣợc vạch đặc hiệu ở mẫu đối chứng âm. Do đó, các phản ứng PCR đều hoạt động tốt và không có hiện tƣợng tạp chéo giữa các phản ứng. Ở 3 ống giống sau đông khô không thấy có vạch PCR đặc hiệu đối với 08 loại virus/ mycoplasma đƣợc xét nghiệm và âm tính với PCV1. Nhƣ vậy, kết quả kiểm tra thuần khiết cho thấy có 3 chủng đều đạt tiêu chuẩn thuần khiết.
4.1.3. Kết quả tinh khiết PCV2 dùng cho sản xuất vacxin thử nghiệm
Trong quá trình nghiên cứu cô đặc virus, chúng tôi đã thử nghiệm các tốc độ ly tâm khác nhau (cố định thời gian ly tâm) để tìm đƣợc tốc độ ly tâm có khả năng tủa virus nhiều nhất. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của tốc độ ly tâm tới khả năng tủa virus
TT Tốc độ (vòng/ phút) Thời gian (giờ) PCR 1 20.000 6 Dƣơng tính 2 35.000 6 Dƣơng tính yếu
Kết quả trình bày ở bảng 4.1 cho thấy, ở tốc độ ly tâm 20.000 vòng/ phút, vẫn phát hiện đƣợc virus lẫn trong dịch sau ly tâm bằng phản ứng PCR. Tuy nhiên, ở tốc độ ly tâm 35.000 vòng/ phút, chúng tôi chỉ quan sát đƣợc vạch PCR đặc hiệu rất mờ. Nhƣ vậy, cần cô đặc PCV2 ở huyễn dịch tế bào sau gây nhiễm (môi trƣờng DMEM) ít nhất ở 35.000 vòng/ phút. Kết quả quá trình cô đặc và tinh khiết virus đƣợc trình bày ở hình 4.3.
Hình 4.3. Kết quả cô đặc và tinh khiết PCV2
Sau quá trình ly tâm ở tốc độ 35.000 vòng/ phút, sau 6 giờ ly tâm có thể thu đƣợc tủa virus bám vào đáy ống ly tâm (hình 4.1 A). Kết quả ly tâm tủa virus thu đƣợc qua gradient đƣờng (hình 4.1 B) thu đƣợc 1 dải có màu đục, trong khoảng nồng độ đƣờng 10% và 20% ban đầu. Nhƣ vậy, với phƣơng pháp đã dùng chúng tôi cô đặc và tinh khiết thành công PCV2.
4.1.4. Kết quả nghiên cứu vô hoạt PCV2 để chế vacxin
Do bộ gen toàn vẹn của PCV2 có khả nhiễm vào tế bào và thực hiện quá trình sinh tổng hợp hạt virus mới (Fenaux và cs., 2002) nên Binary ethyleneimine đƣợc lựa chọn là hóa chất để bất hoạt virus. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Kết quả kiểm tra vô hoạt PCV2
Thời gian bất hoạt (giờ)
Kết quả kiểm tra
IFA RT-PCR 2 + + 4 + + 6 + + 8 - + 10 - - 12 - - 16 - - 20 - - 24 - - 36 - - 40 - - 44 - - 48 - -
Kết quả cho thấy, huyễn dịch virus xử lý bằng BEI 0,2% trong vòng 6 giờ vẫn cho tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu khi gây nhiễm trở lại trên môi trƣờng tế bào PK15. Các mẫu virus sau bất hoạt 8 giờ đều không quan sát đƣợc tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu. Kiểm tra sự nhân lên của PCV2 trên môi trƣờng tế bào bằng phản ứng RT-PCR, chúng tôi thấy virus sau bất hoạt 8 giờ vẫn cho kết quả dƣơng tính. Sau thời gian bất hoạt 10 giờ các kết quả kiểm tra bằng IFA và RT- PCR đều âm tính, chứng tỏ virus đã bị bất hoạt hoàn toàn. Để khẳng định sự bất hoạt là hoàn toàn, chúng tôi tiếp đời 3 lần virus sau bất hoạt 24 giờ trên môi trƣờng tế bào PK15. Kiểm tra bằng IFA đều cho kết quả âm tính ở cả 3 lần tiếp đời. Nhƣ vậy, kết quả nghiên cứu bất hoạt cho thấy PCV2 bị bất hoạt bởi BEI 0,2%, thời gian bất hoạt tối thiểu là 10 giờ.
Trong quá trình nghiên cứu sản xuất vacxin vô hoạt PCV2 thử nghiệm, chúng tôi đã dùng IMS 1313 (Seppic) làm chất bổ trợ. Kháng nguyên là 03 chủng virus vô hoạt đƣợc trộn với tỉ lệ thể tích là 1:1:1 và có 105 TCID50/ml.
Vacxin vô hoạt PCV2 thử nghiệm đƣợc đặt tên là CircoVNUA (kết hợp giữa từ Circovirus và tên của cơ quan chủ trì đề tài: Vietnam National University of Agriculture).
4.1.5. Kết quả kiểm tra vô trùng của vacxin vô hoạt PVC2
Kiểm tra vô trùng vacxin vô hoạt PCV2 thử nghiệm theo phƣơng pháp thƣờng quy tại bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, khoa Thú y và theo TCVN 8684 – 2011.
Để kiểm tra độ vô trùng của vacxin vô hoạt PCV2 có thể bơm vacxin vào môi trƣờng tế bào và các môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn thông thƣờng.
Kết quả kiểm tra vô trùng đƣợc thể hiện ở bảng 4.3.
Bảng 4.3. Kết quả kiểm tra vô trùng của vacxin vô hoạt PCV2
Tên môi trƣờng Mục đích kiểm tra Kết quả
Fluid thioglyconat Vi khuẩn yếm khí - Tryptone soya agar Vi khuẩn hiếu khí - Thạch máu Vi khuẩn hiếu khí, gây dung huyết - Canh thang thịt Vi khuẩn hiếu khí -
Thạch Sabouraud Nấm -
Tryptone soya broth Nấm -
Canh thang PPLO Mycoplasma -
Thạch PPLO Mycoplasma -
DPN-cystein Mycoplasma -
Thạch Macconkey Salmonella, E.coli - Thạch Salmonella -Shigella. Salmonella -
Thạch brilliant green Salmonella -
Thạch Desoxycholat xitrat Salmonella - Thạch xyloza lysin deoxycholat
(thạch XLD) Salmonella -
Canh thang selenit Salmonella -
Canh thang tetrathionat Salmonella - Môi trƣờng tế bào PK15 CSFV, PRRSV, PPV, PEDV,
TGEV, PRV, PAdV, PCV1 -
Nếu có hiện tƣợng tạp khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy môi trƣờng đục, chuyển màu vàng (do vi khuẩn nhân lên khiến cho pH môi trƣờng giảm, chỉ thị đỏ phenol chuyển môi trƣờng từ màu đỏ sang màu vàng), mùi thối đặc trƣng (do môi trƣờng có huyết thanh bào thai bê và dinh dƣỡng cao nên thối rất nhanh).
Kiểm tra trên môi trƣờng tế bào PK 15, toàn bộ dịch nuôi cấy tế bào trong, màu đỏ, không có mùi, không có màng, không có tế bào mọc trên thành chai nuôi cấy, chứng tỏ vacxin PCV2 đạt vô hoạt. Bơm vacxin vào các môi trƣờng nhƣ nƣớc thịt, thạch thƣờng, thạch máu, thạch MacConkey, thạch nấm Sabouraud… Sau khi nuôi cấy 24 giờ ở 37oC (riêng thạch nấm để ở nhiệt độ phòng và theo dõi trong 5 - 7 ngày) tiến hành kiểm tra vi khuẩn đều cho kết quả âm tính. Nhƣ vậy, có thể khẳng định vacxin PCV2 sau vô hoạt đã đạt độ vô trùng.
Kết quả kiểm tra vacxin PCV2 thử nghiệm đều đảm bảo chỉ tiêu vô trùng và thuần khiết theo phƣơng pháp thƣờng quy tại bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, khoa Thú y và theo TCVN 8684-2011.