Mồi Trình tự mồi (5’ - 3’) Vị trí
PCV2F CCAGGAGGGCGTTGTGACT 1535-1553
PCV2R CGCTACCGTTGGAGAAGGAA 1614-1633
PCV2S FAM-AATGGCATCTTCAACACCCGCCTCT-TAMRA 1592-1612
- Các trang thiết bị khác (tủ lạnh, nồi hấp, máy PCR, máy ly tâm, kính hiển vi huỳnh quang, v.v...) của phòng thí nghiệm phục vụ nghiên cứu.
3.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1. Phƣơng pháp tách, tinh sạch ADN tổng số
Các bƣớc tinh sạch ADN tổng số từ mẫu đƣợc thực hiện nhƣ sau:
(1) Ly giải mẫu
- 250 µl huyễn dịch mẫu bệnh phẩm đƣợc trộn đều trong 500 µl dung dịch sucrose/proteinase K,
(2) Tách pha ADN bằng phenol-chloroform-isoamyl (25:24:1) - Bổ sung 200 µl dung dịch PCI vào ống mẫu sau khi ly giải - Vortex hỗn hợp,
- Ly tâm 12.000 vòng/phút/ 15 phút, ở nhiệt độ 4oC
(3) Tủa ADN
- Dùng ống Eppendorf mới, trộn 450 μl isopropyl + 450 μl dịch nổi phía trên, trộn đều
- Tủa ADN ở -20oC/15 phút
- Ly tâm, 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4 oC.
(4) Rửa tủa ADN
- Rửa mẫu bằng 1ml cồn 70% (pha trong nƣớc cất đã xử lý DEPC) - Ly tâm, 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4oC.
- Loại bỏ hết cồn. Hong khô ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
(5) Hòa tan tủa ADN
- Tủa ADN đƣợc hòa tan trong 30 µl dung dịch đệm TE (pH = 8,0).
3.2.2. Phƣơng pháp tách, tinh sạch ARN tổng số
Các bƣớc chiết tách ARN tổng số đƣợc thực hiện nhƣ sau:
(1) Ly giải mẫu
- 250 µl huyễn dịch tế bào đƣợc trộn đều trong 750 µl TRIzol Reagent - Vortex mạnh hỗn hợp
- Giữ ở nhiệt độ phòng trong vòng 15 phút
(2) Tách pha ARN
- Bổ sung 200 µl dung dịch chloroform vào ống mẫu sau khi ly giải - Vortex hỗn hợp,
- Ly tâm 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4oC
(3) Tủa ARN
- Dùng ống Eppendorf mới, trộn 450 μl isopropyl + 450 μl dịch nổi phía trên (thu đƣợc sau bƣớc 2), trộn đều
- Ly tâm, 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4oC.
(4) Rửa tủa ARN
- Rửa mẫu bằng 1ml cồn 75% (pha trong nƣớc cất đã xử lý DEPC) - Ly tâm 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4oC.
- Loại bỏ hết cồn. Hong khô ở nhiệt độ phòng trong khoảng 15 phút.
(5) Hòa tan tủa ARN
- Tủa ARN đƣợc hòa tan trong 30µl nƣớc cất 3 lần đã xử lý DEPC. - ARN sau tách chiết đƣợc bảo quản ở -70oC
3.2.3. Phƣơng pháp PCR phát hiện các virus và mycoplasma tạp nhiễm
Danh mục mồi đặc hiệu phát hiện tạp nhiễm virus và mycoplasma đƣợc trình bày ở bảng 3.2. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kít PCR i-Star Master, với các thành phần đƣợc phối hợp sẵn. Thể tích cuối cùng của phản ứng là 20 µl gồm 17 µl i-Star Master mix solution + 1 µl mồi xuôi + 1 µl mồi ngƣợc + 1 µl ADN mẫu tách chiết hoặc cDNA. Chu trình nhiệt tối ƣu của các phản ứng PCR dùng trong nghiên cứu này đƣợc trình bày ở bảng 3.4.