PCV2 đƣợc phát hiện ở một số tỉnh thành phía Nam từ năm 2000 với tỷ lệ nhiễm 38,97% nhƣng đến 2006 tỷ lệ nhiễm đã tăng đến 96,47%, chứng tỏ PCV2 đang lƣu hành phổ biến trong chăn nuôi lợn (Nguyễn Thị Thu Hồng và cs., 2006) và là một trong những nguyên nhân gây còi cọc lợn con cai sữa ở một số trại lợn tại thành phố Hồ Chí Minh. Một số nghiên cứu của tác giả nhƣ (Lam và Dƣơng, 2006) đều cho thấy có sự lƣu hành của PCV2 ở đàn lợn nuôi tại thành phố Hồ Chí Minh.
Trong một số nghiên cứu gần đây nhất (Huỳnh Thị Mỹ Lệ và cs., 2012a) thực hiện tại một số trại lợn nuôi tại 4 tỉnh ở miền Bắc nhƣ Hà Nội, Hòa Bình, Bắc Giang, và Hải Dƣơng cho thấy 43/48 (89,58%) trại lợn đƣợc điều tra cho kết quả huyết thanh học dƣơng tính với PCV2. Cụ thể số trại lợn đƣợc khảo sát cho kết quả huyết thanh học dƣơng tính với PCV2 tại Hà Nội là 13/15 trại, chiếm (86,67); tại Hải Dƣơng là 14/16 trại, chiếm 87,5%; tại Bắc Giang là 8/8 trại, chiếm 100%; và tại Hòa Bình là 8/9 trại, chiếm 88,89%. Kết quả nghiên cứu cho thấy không có sự sai khác về tỷ lệ trại lợn cho kết quả huyết thanh học dƣơng tính với PCV2 giữa 4 tỉnh đƣợc khảo sát (p>0,05). Với tổng số 513 mẫu huyết thanh đƣợc kiểm tra, tỷ lệ mẫu huyết thanh cho kết quả dƣơng tính với PCV2 trung bình là 70,57%. Kết quả khảo sát huyết thanh học theo quy mô chăn nuôi cho thấy các đàn lợn nuôi có quy mô khác nhau thì tỷ lệ mẫu huyết thanh dƣơng tính với PCV2 là khác nhau. Những đàn lợn nuôi có quy mô từ 100 - 500 con và từ 500 – 1000 con cho kết quả huyết thanh học dƣơng tính với PCV2 cao nhất, tỷ lệ mẫu huyết thanh học dƣơng tính tƣơng ứng là 86,86% và 80,21%. Kết quả điều tra theo lứa tuổi cho thấy lợn thịt cho kết quả huyết thanh học dƣơng tính với PCV2 là 61,27%, thấp nhất trong các lứa tuổi lợn đƣợc khảo sát. Lợn nái cho kết quả huyết thanh học dƣơng tính với PCV2 cao nhất (92,31%), tiếp đến là lợn
con theo mẹ (88,24%) (Huỳnh Thị Mỹ Lệ và cs., 2012a).
Nghiên cứu biểu hiện lâm sàng của lợn nghi mắc PMWS thu thập đƣợc tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam cho thấy lợn có các triệu chứng và bệnh tích giống nhƣ các kết quả đã đƣợc công bố trƣớc đây (Plana-Duran et al., 1999). Triệu chứng lâm sàng chủ yếu đối với lợn nghi mắc PMWS là còi cọc, lông khô và xơ xác (100%), đặc biệt có đến 89,74% lợn nghi mắc PMWS có có triệu chứng hô hấp. Bệnh tích đại thể đặc trƣng gồm hiện tƣợng xác gầy và sƣng, xuất huyết ở các hạch lympho, viêm phổi. Những biến đổi vi thể đặc trƣng đối với lợn nghi PMWS có liên quan đến PCV2 đƣợc tìm thấy tại các cơ quan nội tạng của lợn bệnh bao gồm viêm mãn tính và phá hủy các mạch máu (ở phổi, hạch lympho, thận, gan), viêm dạng hạt với sự hình thành các tế bào khổng lồ đa nhân (ở phổi, hạch lympho), biến đổi miền vỏ và miền dƣới vỏ hạch lympho làm vỡ cấu trúc hai miền vỏ-tủy của hạch, thoái hóa các quai henle ở thận (Huỳnh Thị Mỹ Lệ và cs., 2012b).
Kết quả giải mã genome đối với 30 chủng PCV2 thu nhận đƣợc từ các mẫu huyết thanh, mẫu mô (gan, phổi, lách, và hạch) của lợn nghi mắc PMWS cho thấy các chủng PCV2 đang lƣu hành và gây bệnh trên đàn lợn nuôi tại Việt Nam thuộc genotype PCV2b với 4 nhóm (cluster) khác nhau là 1A, 1B, 1C và dạng tái tổ hợp (recombinant form). Kết quả phân tích về trình tự gen cho thấy genome của chúng gồm 1.767 nucleotide và giống nhau 96 – 100% (Huynh et al., 2014).
Vacxin là yếu tố quyết định trong công tác phòng chống hội chứng còi cọc ở lợn con sau cai sữa và vacxin sẽ chỉ cho hiệu quả phòng bệnh cao nhất khi chủng virus vacxin đƣợc phân lập từ thực địa. Trên thế giới, một số vacxin vô hoạt đã đƣợc sản xuất thành công trên môi trƣờng tế bào PK15 và cho thấy hiệu quả cao trong phòng chống hội chứng còi cọc ở lợn con sau cai sữa xảy ra (Lyoo et al., 2011, Opriessnig et al., 2009a, Chae, 2012a, Yang et al., 2012).
Đề tài nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ của Huỳnh Thị Mỹ Lệ và cộng sự về việc nghiên cứu chọn chủng virus Porcine circovirus type 2 (PCV2) để sản xuất vắc xin phòng bệnh còi cọc ở lợn con đã bƣớc đầu thành công trong việc xây dựng ngân hàng giống virus PCV2 phân lập đƣợc, nghiên cứu đặc tính sinh học của chủng PCV2 dùng làm giống gốc để sản xuất vacxin, nghiên cứu bảo quản và xác định các đặc tính của giống vacxin PCV2 sau bảo quản.
Kết quả nghiên cứu đã tìm ra 3 chủng có hiệu giá ≥ 105 TCID50/ml là chủng 03, 04 và 07 sau các lần tiếp đời lần lƣợt là 14, 20 và 16. Kết quả chuẩn độ PCV2 bằng phản ứng IFA để xác định hiệu giá virus ở các lần tiếp đời đối với các chủng virus này cho thấy hiệu giá ổn định (biến động không vƣợt quá 1 log) trong phạm vi: (i) đời 18 ÷ đời 26 (chủng 03), (ii) đời 20 ÷ đời 26 (chủng 04) và (iii) đời 16 ÷ đời 26 (chủng 07). Kết quả trên phù hợp với một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy PCV2 có sự tăng hiệu giá qua các lần tiếp đời và ổn định sau khoảng 16 đến 25 lần tiếp đời (Shuai et al., 2011), đạt hiệu giá 105,6 TCID50/ml ở lần tiếp đời thứ 35 (Liu et al., 2006a). Nhƣ vậy, thí nghiệm nghiên cứu biến động hiệu giá virus qua các lần tiếp đời cho phép kết luận:
(1) Đã xác định đƣợc 3 chủng virus có hiệu giá ≥ 105 TCID50/ 0,1 ml là: Chủng phân lập 03: 106,33 TCID50/ 0,1 ml ở đời 18
Chủng phân lập 04: 106,18 TCID50/ 0,1 ml ở đời 20 Chủng phân lập 07: 105,73 TCID50/ 0,1 ml ở đời 16
(2) Cả 3 chủng phân lập kể trên có hiệu giá ổn định trong phạm vi đời 18 ÷ đời 26 (chủng 03), đời 20 ÷ đời 26 (chủng 04) và đời 16 ÷ đời 26 (chủng 07). Có thể chọn virus từ đời 18 (chủng 03), từ đời 20 (chủng 04) và từ đời 16 (chủng 07) để tiếp tục nghiên cứu.
Bằng phƣơng pháp xây dựng cây phát sinh loài dựa vào trình tự genome hoặc gen mã hóa capsid protein cho thấy 3 chủng PCV2 này thuộc về nhóm 1C (chủng phân lập 07), 1A/1B (chủng phân lập 04) và nhóm tái tổ hợp (CRF) lƣu hành phổ biến ở Việt Nam (chủng phân lập 03).
Nghiên cứu tính ổn định di truyền của các chủng virus qua các lần tiếp đời, chúng tôi phân tích trình tự gen ORF2 ở 4 vùng mã hóa protein đóng vai trò quan trọng trong kích thích sản sinh đáp ứng miễn dịch của vật chủ (Trible và cs., 2011): vùng A (nucleotide 151- 252), vùng B (nucleotide 337 – 393), vùng C (nuleotide 481- 621), vùng D (nucleotide 682- 699). Dựa vào kết quả nghiên cứu ổn định hiệu giá virus chúng tôi lựa chọn một số đời để so sánh trình tự gen giữa các lần tiếp đời của mỗi chủng với virus ở mẫu bệnh phẩm (P0) tƣơng ứng.
Kết quả phân tích cho thấy trình tự gen 4 vùng quyết định kháng nguyên A- D ở các lần tiếp đời khác nhau đƣợc xác định không có sự sai khác với virus có trong mẫu bệnh phẩm ban đầu (P0). Nói cách khác, 3 chủng PCV2 ổn định về mặt di truyền.
tính sinh miễn dịch. Trƣớc khi tiến hành trên bản động vật chúng tôi kiểm tra khả năng sản sinh đáp ứng miễn dịch của thỏ sau khi đƣợc gây miễn dịch bằng PCV2 ở các đời khác nhau. Kết quả phân tích biến động hàm lƣợng kháng thể kháng PCV2 của thỏ đƣợc gây miễn dịch cho thấy 3 chủng PCV2 ở các lần tiếp đời đều có khả năng kích thích sản sinh đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu. Hiện tƣợng chuyển dƣơng tính huyết thanh học xảy ra trong khoảng 7 đến 14 ngày sau khi gây miễn dịch và độ dài miễn dịch ít nhất đến 56 ngày sau tiêm kháng nguyên.
Kết quả cho thấy chủng PCV2 số 03, 04 và 07 đều có khả năng kích thích sản sinh đáp ứng miễn dịch đặc hiệu trên thỏ. Cùng một chủng virus, khi gây miễn dịch cho thỏ ở các đời khác nhau, không phát hiện thấy có khác biệt về quy luật hình thành kháng thể.
Dùng virus ở các lần tiếp đời khác nhau, đã đƣợc bất hoạt để gây miễn dịch cho lợn âm tính PCV2 và âm tính với kháng thể kháng PCV2. Tiến hành theo dõi biểu hiện lâm sàng của lợn sau gây miễn dịch chúng tôi không phát hiện thấy dấu hiệu bất thƣờng của lợn thí nghiệm tại vị trí tiêm cũng nhƣ phản ứng toàn thân.
Với các kết quả đặc tính sinh học của ngân hàng giống, nghiên cứu này chúng tôi đã chọn đƣợc 3 chủng PCV2 (chủng 03, 04 và 07) có hiệu giá lớn hơn 105
TCID50/ml, có tính ổn định về: hiệu giá, đặc điểm di truyền và đặc tính sinh miễn dịch để sản xuất vacxin thử nghiệm.
Việc tiếp theo là tiến hành nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin phòng bệnh còi cọc ở lợn con do PCV2 gây ra. Nhƣ vậy, hƣớng nghiên cứu tự sản xuất vacxin vô hoạt từ chính những chủng PCV2 đang lƣu hành tại Việt Nam là rất cần thiết, là một nghiên cứu mới, có tính ứng dụng cao.
PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. NỘI DUNG, ĐỊA ĐIỂM, ĐỐI TƯỢNG VÀ NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU
3.1.1. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu kiểm tra độ tinh khiết và vô trùng của vacxin PCV2
- Đánh giá chỉ tiêu an toàn của vacxin vô hoạt PCV2 khi tiêm thử nghiệm trên lợn.
- Nghiên cứu đánh giá hàm lƣợng kháng thể ở lợn đƣợc tiêm vacxin vô hoạt PCV2 sản xuất thử nghiệm và so sánh với vacxin thƣơng mại khác.
3.1.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: Bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, bộ môn Giải phẫu – Tổ chức, bộ môn Bệnh lý, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Thời gian: Từ 04/2015 đến 09/2016
3.1.3. Đối tƣợng nghiên cứu
- Chủng virus PCV2 đƣợc lựa chọn
- Vacxin vô hoạt PCV2 đƣợc sản xuất từ chủng PCV2 phân lập tại Việt Nam
3.1.4. Nguyên liệu nghiên cứu
- Mẫu nghiên cứu: huyết thanh của lợn, động vật thí nghiệm - Chủng PCV2 phân lập tại Việt Nam, vacxin PCV2 thƣơng mại - Tế bào PK15 và môi trƣờng nuôi cấy (DMEM + 5% FBS), - Kit PCR i-StarMaster (iNtRON Biotechnology, Hàn Quốc)
- ADN chuẩn của PCV2a và PCV2b do phòng thí nghiệm virus học, Trƣờng đại học Thú y, Đại học Quốc gia Seoul (Hàn Quốc) cung cấp.
- Kít tổng hợp cDNA
- Hóa chất dùng tách chiết ADN tổng số gồm: (1) dung dịch ly giải mẫu có chứa 27% sucrose, 15 mM trisodium citrate, 0,15 M NaCl, 1 mM ethylene diaminetetraacetic acid, 1% sodium dodecyl sulphate, 200 µg/ml proteinase K;
(2) phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1); (3) isopropyl; (4) cồn 70%; (5)
dung dịch đệm TE (pH=8).
- Kít IFA đặc hiệu cho PCV2: VDPro PCV2 FA Reagent (Median Diagnostics, Hàn Quốc).
- Các cặp mồi đặc hiệu dùng trong nghiên cứu này đƣợc lựa chọn dựa theo các nghiên cứu đã công bố trƣớc đây, bao gồm: mồi đặc hiệu chung và đặc hiệu genotype PCV2 (bảng 2.1), mồi đặc hiệu dùng cho phát hiện một số virus và
Mycoplasma hyopneumoniae (MHP) tạp nhiễm (bảng 2.2). Các virus đƣợc xét
nghiệm trong kiểm tra tạp nhiễm gồm: virus gây bệnh dịch tả lợn (Classical swine fever virus – CSFV), virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus – PRRSV), Porcine parvovirus (PPV), virus gây bệnh tiêu chảy thành dịch (Porcine epidemic diarrhea virus – PEDV), virus gây bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (Transmissible gastro-enteritis virus – TGEV), virus gây bệnh giả dại (Porcine pseudorabies Virus – PRV), Porcine adenovirus (PadV), và Porcine circovirus type 1 (PCV1).
Bảng 3.1. Trình tự mồi dùng phát hiện và giám định genotype PCV2
Mồi xuôi/ngƣợ c Loại mồi Trình tự mồi (5 ’ - 3’) Kích thƣớ c (bp) Vị trí nucleotid e Tài liệu tham khảo CV1/CV2 PCV2a , PCV2b AGGGCTGTGGCCTTTGTTAC 989 1329- 1348 (Fenau x và cs., 2000) TCTTCCAATCACGCTTCTGC 530-549 CV3/CV4 PCV2a , PCV2b TGGTGACCGTTGCAGAGCAG 1092 452–471 TGGGCGGTGGACATGATGAG 1525– 1544 VF2/VR2 PCV2a , PCV2b GAAGAATGGAAGAAGCGG 360 62-79 (Yang và cs., 2003) CTCACAGCAGTAGACAGGT 403-421 2aF/VR2* PCV2a GGGTATAGAGATTTTGTTGG TC 728 1460- 1481 (Kim và cs., 2011) CTCACAGCAGTAGACAGGT 403-421 2bF/VR2* PCV2b CACAGAGCGGGGGTTTGAGC 726 1462- 1481 CTCACAGCAGTAGACAGGT 403-421
* Sự kết hợp mồi dùng xác định genotype của PCV2 được điều chỉnh bằng cách sử dụng mồi ngược VR2 có trình tự phù hợp với các chủng PCV2 lưu hành ở Việt Nam.
Cặp mồi để chẩn đoán (CV1/CV2; VF2/VR2); cặp mồi để định type (2aF/VR2 và 2bF/VR2); cặp mồi để giải trình tự (CV1/CV2; CV3/CV4).
Bảng 3.2. Trình tự mồi dùng xác định sự tạp nhiễm virus và mycoplasma
Virus Mồi Trình tự mồi (5’ - 3’)
Kích thƣớ c (bp) Vị trí nucleotid e TLTK CSFV CSFV- F GTCGTCAGTAGTTCGACG 777 182-200 (Xu và cs., 2012) CSFV- R ATGCTCTTTTGGGGCTAT 959-941 PRRS V PRRSV -F GAGTTTCAGCGGAACAATGG 451 14359- 14379 PRRSV -R GCCGTTGACCGTAGTGGAG 14810- 14791 PPV PPV-F AGTTAGAATAGGATGCGAGGA A 265 1761- 1782 PPV-R AGAGTCTGTGGTGTATTTATT GG 2026- 2002 PEDV PcF1 ACAAGTCTCGTAACCAGT 691 26971- 26988 (Kamau và cs., 2010) PcR1 GTATCACCACCATCAACAGC 27642- 27661 TGEV T1 GTGGTTTTGTYRTAAATGC 859 16-35 (Kim và cs., 2001) T2 CACTAACCAACGTGGARCTA 855-874 MHP MHP- 2L CCCTTTGTCTTAATTTTTGAA 808 102-123 (Stark và cs., 1998) MHP- 2R GCCGATTCTAGTACCCTAATC C 909-888 PRV PRV-F GGGGTTGGACAGGAAGGACA CCA 198 17205- 17228 (Xu và cs., 2012) PRV-R AACCAGCTGCACGCGCTCAA 17403- 17483
GT 20733 a và cs., 2006) PARN GGAATGGAGATGGGCAGGTT 21035- 21054 PCV1 PCV1- iF CCTTCCGAGGAGGAGAAAAAC 491 879-900 (Kim và Chae, 2003) PCV1- oR AAATTACGGGCCCACTGGCT 1350- 1369
- Kit real-time PCR: TaqMan Universal PCR master mix (Invitrogen). Bộ kit bao gồm các loại sinh phẩm sau:
+) AmpliTaq Gold® DNA Polymerase +) Uracil‐N glycosylase
+) dNTPs with dUTP
+) ROX Passive Reference Dye
- Cặp mồi và đầu dò (probe) đặc hiệu dùng xác định hiệu giá TCID50/ml của PCV2 đƣợc lựa chọn dựa theo nghiên cứu đã công bố trƣớc đây (Olvera và cs., 2004) và đƣợc trình bày trong bảng 2.3.
Bảng 3.3. Trình tự cặp mồi, đầu dò dùng xác định hiệu giá PCV2
Mồi Trình tự mồi (5’ - 3’) Vị trí
PCV2F CCAGGAGGGCGTTGTGACT 1535-1553
PCV2R CGCTACCGTTGGAGAAGGAA 1614-1633
PCV2S FAM-AATGGCATCTTCAACACCCGCCTCT-TAMRA 1592-1612
- Các trang thiết bị khác (tủ lạnh, nồi hấp, máy PCR, máy ly tâm, kính hiển vi huỳnh quang, v.v...) của phòng thí nghiệm phục vụ nghiên cứu.
3.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1. Phƣơng pháp tách, tinh sạch ADN tổng số
Các bƣớc tinh sạch ADN tổng số từ mẫu đƣợc thực hiện nhƣ sau:
(1) Ly giải mẫu
- 250 µl huyễn dịch mẫu bệnh phẩm đƣợc trộn đều trong 500 µl dung dịch sucrose/proteinase K,
(2) Tách pha ADN bằng phenol-chloroform-isoamyl (25:24:1) - Bổ sung 200 µl dung dịch PCI vào ống mẫu sau khi ly giải - Vortex hỗn hợp,
- Ly tâm 12.000 vòng/phút/ 15 phút, ở nhiệt độ 4oC
(3) Tủa ADN
- Dùng ống Eppendorf mới, trộn 450 μl isopropyl + 450 μl dịch nổi phía trên, trộn đều
- Tủa ADN ở -20oC/15 phút
- Ly tâm, 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4 oC.
(4) Rửa tủa ADN
- Rửa mẫu bằng 1ml cồn 70% (pha trong nƣớc cất đã xử lý DEPC) - Ly tâm, 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4oC.
- Loại bỏ hết cồn. Hong khô ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
(5) Hòa tan tủa ADN
- Tủa ADN đƣợc hòa tan trong 30 µl dung dịch đệm TE (pH = 8,0).
3.2.2. Phƣơng pháp tách, tinh sạch ARN tổng số
Các bƣớc chiết tách ARN tổng số đƣợc thực hiện nhƣ sau:
(1) Ly giải mẫu
- 250 µl huyễn dịch tế bào đƣợc trộn đều trong 750 µl TRIzol Reagent - Vortex mạnh hỗn hợp
- Giữ ở nhiệt độ phòng trong vòng 15 phút
(2) Tách pha ARN
- Bổ sung 200 µl dung dịch chloroform vào ống mẫu sau khi ly giải - Vortex hỗn hợp,
- Ly tâm 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4oC
(3) Tủa ARN
- Dùng ống Eppendorf mới, trộn 450 μl isopropyl + 450 μl dịch nổi phía trên (thu đƣợc sau bƣớc 2), trộn đều
- Ly tâm, 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4oC.
(4) Rửa tủa ARN
- Rửa mẫu bằng 1ml cồn 75% (pha trong nƣớc cất đã xử lý DEPC) - Ly tâm 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4oC.
- Loại bỏ hết cồn. Hong khô ở nhiệt độ phòng trong khoảng 15 phút.
(5) Hòa tan tủa ARN
- Tủa ARN đƣợc hòa tan trong 30µl nƣớc cất 3 lần đã xử lý DEPC. - ARN sau tách chiết đƣợc bảo quản ở -70oC
3.2.3. Phƣơng pháp PCR phát hiện các virus và mycoplasma tạp nhiễm