Phần 3 Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.11. Phƣơng pháp phát hiện kháng thể kháng PCV2
Các bƣớc thực hiện phản ứng blocking ELISA phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng PCV2 trong mẫu huyết thanh của động vật thí nghiệm:
(a) Pha loãng huyết thanh
Huyết thanh chẩn đoán đƣợc pha loãng 1/100 trong dung dịch pha loãng mẫu. Để đạt đƣợc độ pha loãng cuối cùng này, huyết thanh đƣợc pha loãng 1/10 trƣớc khi chuyển vào đĩa phản ứng.
Pha loãng huyết thanh 1/10 bằng dung dịch sample diluent buffer trong đĩa 96 giếng: (i) chia 90 µl sample diluent buffer vào các giếng, (ii) cho 10ul huyết thanh/ giếng, (iii) vỗ nhẹ đĩa (mixing) để trộn đều.
Pha loãng huyết thanh 1/100 trong đĩa phản ứng: (i) cho 100 µl đối chứng âm vào mỗi giếng A1, B1; (ii) cho 100 µl đối chứng dƣơng vào giếng C1, D1; (iii) chia 90 µl sample diluent buffer vào các giếng làm phản ứng; (iv) cho 10 µl huyết thanh đã pha loãng 1/10 vào mỗi giếng; (v) vỗ nhẹ đĩa (mixing) để trộn đều và dán đĩa bằng tấm dán chuyên dụng.
(b) Ủ mẫu
Ủ đĩa ở 37oC/60 phút ( 5 phút), tránh ánh sáng
Rửa 4 lần, 200 µl/lần bằng dung dịch rửa (washing solution 1X)
(c) Cho kháng thể đặc hiệu gắn enzyme
Pha loãng conjugate (kháng thể đặc hiệu kháng PCV2 gắn enzyme) Tính toán lƣợng conjugate cần dùng:
Lƣợng cần pha = (số giếng phản ứng + 4) x 100 µl Pha conjugate 1/100
Ủ conjugate và mẫu
Cho 100 µl conjugate đã pha loãng vào toàn bộ giếng phản ứng Ủ 37oC trong 60 phút ( 5 phút), tránh ánh sáng
Rửa 4 lần, 200 µl/lần bằng dung dịch rửa (washing solution 1X)
(d) Cho cơ chất/chất màu (Buffered peroxidase substrate)
Để ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng trong vòng 20 phút
(e) Dừng phản ứng
Thêm 50 µl dung dịch H2SO4 2N để dừng phản ứng Vỗ nhẹ đĩa để trộn đều
Đĩa phản ứng sau khi dừng phản ứng cần đƣợc đo ngay giá trị OD.
(f) Đo giá trị OD, tính toán kết quả
Giá trị OD đo ở bƣớc sóng 450 nm. Kết quả của phản ứng đƣợc đánh giá hợp lệ nếu giá trị OD trung bình của đối chứng âm > 0,800 và giá trị OD trung bình của đối chứng dƣơng < 0,600. Tính giá trị S/N (OD mẫu xét nghiệm/ OD đối chứng âm). Các bƣớc tính toán đƣợc thực hiện trên bảng tính Excel cung cấp bởi nhà sản xuất. Nếu S/N 0,4, mẫu đƣợc coi dƣơng tính huyết thanh học. Ngƣợc lại nếu S/N > 04, mẫu đƣợc coi âm tính huyết thanh học.