4.1.1. Kết quả xác định sự có mặt của PCV2 trong giống gốc để chế vacxin
Sử dụng phƣơng pháp PCR đã đƣợc tối ƣu hóa, chúng tôi đã khẳng định lại sự có mặt của PCV2 trong 3 mẫu virus phân lập đƣợc của giống gốc chế tạo vacxin. Kết quả đƣợc trình bày ở hình 4.1.
Hình 4.1. Kết quả PCR xác định PCV2 trong giống gốc để chế vacxin
(03, 04, 07: chủng PCV2; đối chứng âm (-) và đối chứng dương (+))
Hình 4.1 cho thấy, 3 mẫu cho kết quả dƣơng tính mạnh với PCV2 khi sử dụng cặp mồi VF2/VR2 nhân lên khoảng 0,2% bộ gen của PCV2. Sản phẩm PCR nhân lên bởi các mẫu virus đều không xuất hiện các vạch phụ.
4.1.2. Kết quả giám định độ thuần khiết của PCV2
Trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra độ thuần khiết của PCV2 với một số virus và mycoplasma thƣờng lƣu hành ở đàn lợn, có khả năng nhân lên trên tế bào PK15, bao gồm: CSFV, PRRSV, PPV, PEDV, TGEV, PRV, PAdV, PCV1 và MHP. Kết quả đƣợc chúng tôi trình bày ở hình 4.2.
Hình 4.2. Kết quả giám định thuần khiết giống PCV2
(03, 04, 07:chủng PCV2 phân lập được ; đối chứng âm (-) và đối chứng dương (+))
Các mẫu đối chứng dƣơng đều cho vạch đặc hiệu có kích thƣớc nhƣ thiết kế; trong khi đó, đều không quan sát đƣợc vạch đặc hiệu ở mẫu đối chứng âm. Do đó, các phản ứng PCR đều hoạt động tốt và không có hiện tƣợng tạp chéo giữa các phản ứng. Ở 3 ống giống sau đông khô không thấy có vạch PCR đặc hiệu đối với 08 loại virus/ mycoplasma đƣợc xét nghiệm và âm tính với PCV1. Nhƣ vậy, kết quả kiểm tra thuần khiết cho thấy có 3 chủng đều đạt tiêu chuẩn thuần khiết.
4.1.3. Kết quả tinh khiết PCV2 dùng cho sản xuất vacxin thử nghiệm
Trong quá trình nghiên cứu cô đặc virus, chúng tôi đã thử nghiệm các tốc độ ly tâm khác nhau (cố định thời gian ly tâm) để tìm đƣợc tốc độ ly tâm có khả năng tủa virus nhiều nhất. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của tốc độ ly tâm tới khả năng tủa virus
TT Tốc độ (vòng/ phút) Thời gian (giờ) PCR 1 20.000 6 Dƣơng tính 2 35.000 6 Dƣơng tính yếu
Kết quả trình bày ở bảng 4.1 cho thấy, ở tốc độ ly tâm 20.000 vòng/ phút, vẫn phát hiện đƣợc virus lẫn trong dịch sau ly tâm bằng phản ứng PCR. Tuy nhiên, ở tốc độ ly tâm 35.000 vòng/ phút, chúng tôi chỉ quan sát đƣợc vạch PCR đặc hiệu rất mờ. Nhƣ vậy, cần cô đặc PCV2 ở huyễn dịch tế bào sau gây nhiễm (môi trƣờng DMEM) ít nhất ở 35.000 vòng/ phút. Kết quả quá trình cô đặc và tinh khiết virus đƣợc trình bày ở hình 4.3.
Hình 4.3. Kết quả cô đặc và tinh khiết PCV2
Sau quá trình ly tâm ở tốc độ 35.000 vòng/ phút, sau 6 giờ ly tâm có thể thu đƣợc tủa virus bám vào đáy ống ly tâm (hình 4.1 A). Kết quả ly tâm tủa virus thu đƣợc qua gradient đƣờng (hình 4.1 B) thu đƣợc 1 dải có màu đục, trong khoảng nồng độ đƣờng 10% và 20% ban đầu. Nhƣ vậy, với phƣơng pháp đã dùng chúng tôi cô đặc và tinh khiết thành công PCV2.
4.1.4. Kết quả nghiên cứu vô hoạt PCV2 để chế vacxin
Do bộ gen toàn vẹn của PCV2 có khả nhiễm vào tế bào và thực hiện quá trình sinh tổng hợp hạt virus mới (Fenaux và cs., 2002) nên Binary ethyleneimine đƣợc lựa chọn là hóa chất để bất hoạt virus. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Kết quả kiểm tra vô hoạt PCV2
Thời gian bất hoạt (giờ)
Kết quả kiểm tra
IFA RT-PCR 2 + + 4 + + 6 + + 8 - + 10 - - 12 - - 16 - - 20 - - 24 - - 36 - - 40 - - 44 - - 48 - -
Kết quả cho thấy, huyễn dịch virus xử lý bằng BEI 0,2% trong vòng 6 giờ vẫn cho tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu khi gây nhiễm trở lại trên môi trƣờng tế bào PK15. Các mẫu virus sau bất hoạt 8 giờ đều không quan sát đƣợc tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu. Kiểm tra sự nhân lên của PCV2 trên môi trƣờng tế bào bằng phản ứng RT-PCR, chúng tôi thấy virus sau bất hoạt 8 giờ vẫn cho kết quả dƣơng tính. Sau thời gian bất hoạt 10 giờ các kết quả kiểm tra bằng IFA và RT- PCR đều âm tính, chứng tỏ virus đã bị bất hoạt hoàn toàn. Để khẳng định sự bất hoạt là hoàn toàn, chúng tôi tiếp đời 3 lần virus sau bất hoạt 24 giờ trên môi trƣờng tế bào PK15. Kiểm tra bằng IFA đều cho kết quả âm tính ở cả 3 lần tiếp đời. Nhƣ vậy, kết quả nghiên cứu bất hoạt cho thấy PCV2 bị bất hoạt bởi BEI 0,2%, thời gian bất hoạt tối thiểu là 10 giờ.
Trong quá trình nghiên cứu sản xuất vacxin vô hoạt PCV2 thử nghiệm, chúng tôi đã dùng IMS 1313 (Seppic) làm chất bổ trợ. Kháng nguyên là 03 chủng virus vô hoạt đƣợc trộn với tỉ lệ thể tích là 1:1:1 và có 105 TCID50/ml.
Vacxin vô hoạt PCV2 thử nghiệm đƣợc đặt tên là CircoVNUA (kết hợp giữa từ Circovirus và tên của cơ quan chủ trì đề tài: Vietnam National University of Agriculture).
4.1.5. Kết quả kiểm tra vô trùng của vacxin vô hoạt PVC2
Kiểm tra vô trùng vacxin vô hoạt PCV2 thử nghiệm theo phƣơng pháp thƣờng quy tại bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, khoa Thú y và theo TCVN 8684 – 2011.
Để kiểm tra độ vô trùng của vacxin vô hoạt PCV2 có thể bơm vacxin vào môi trƣờng tế bào và các môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn thông thƣờng.
Kết quả kiểm tra vô trùng đƣợc thể hiện ở bảng 4.3.
Bảng 4.3. Kết quả kiểm tra vô trùng của vacxin vô hoạt PCV2
Tên môi trƣờng Mục đích kiểm tra Kết quả
Fluid thioglyconat Vi khuẩn yếm khí - Tryptone soya agar Vi khuẩn hiếu khí - Thạch máu Vi khuẩn hiếu khí, gây dung huyết - Canh thang thịt Vi khuẩn hiếu khí -
Thạch Sabouraud Nấm -
Tryptone soya broth Nấm -
Canh thang PPLO Mycoplasma -
Thạch PPLO Mycoplasma -
DPN-cystein Mycoplasma -
Thạch Macconkey Salmonella, E.coli - Thạch Salmonella -Shigella. Salmonella -
Thạch brilliant green Salmonella -
Thạch Desoxycholat xitrat Salmonella - Thạch xyloza lysin deoxycholat
(thạch XLD) Salmonella -
Canh thang selenit Salmonella -
Canh thang tetrathionat Salmonella - Môi trƣờng tế bào PK15 CSFV, PRRSV, PPV, PEDV,
TGEV, PRV, PAdV, PCV1 -
Nếu có hiện tƣợng tạp khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy môi trƣờng đục, chuyển màu vàng (do vi khuẩn nhân lên khiến cho pH môi trƣờng giảm, chỉ thị đỏ phenol chuyển môi trƣờng từ màu đỏ sang màu vàng), mùi thối đặc trƣng (do môi trƣờng có huyết thanh bào thai bê và dinh dƣỡng cao nên thối rất nhanh).
Kiểm tra trên môi trƣờng tế bào PK 15, toàn bộ dịch nuôi cấy tế bào trong, màu đỏ, không có mùi, không có màng, không có tế bào mọc trên thành chai nuôi cấy, chứng tỏ vacxin PCV2 đạt vô hoạt. Bơm vacxin vào các môi trƣờng nhƣ nƣớc thịt, thạch thƣờng, thạch máu, thạch MacConkey, thạch nấm Sabouraud… Sau khi nuôi cấy 24 giờ ở 37oC (riêng thạch nấm để ở nhiệt độ phòng và theo dõi trong 5 - 7 ngày) tiến hành kiểm tra vi khuẩn đều cho kết quả âm tính. Nhƣ vậy, có thể khẳng định vacxin PCV2 sau vô hoạt đã đạt độ vô trùng.
Kết quả kiểm tra vacxin PCV2 thử nghiệm đều đảm bảo chỉ tiêu vô trùng và thuần khiết theo phƣơng pháp thƣờng quy tại bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, khoa Thú y và theo TCVN 8684-2011.
4.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG VACXIN VÔ HOẠT PCV2 THỬ NGHIỆM THỬ NGHIỆM
Chúng tôi dùng 3 lô thí nghiệm. Lô tiêm vacxin vô hoạt PCV2 thử nghiệm gồm 10 lợn, lô tiêm vacxin thƣơng mại gồm 10 lợn và lô đối chứng gồm 7 lợn. Tiến hành theo dõi các chỉ tiêu thân nhiệt, tăng trọng, triệu chứng, bệnh tích đại thể và vi thể của lợn từ thời điểm bắt đầu tiêm vacxin D0 đến D84 sau khi tiêm.
4.2.1. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin vô hoạt PCV2 khi tiêm thử nghiệm trên lợn thử nghiệm trên lợn
Đánh giá chỉ tiêu an toàn của vacxin vô hoạt PCV2 dựa trên kết quả nghiên cứu sự tăng trọng của lợn, triệu chứng và bệnh tích đại thể và vi thể của lợn đƣợc tiêm vacxin.
4.2.1.1. Kết quả nghiên cứu sự tăng trọng của lợn được tiêm vacxin
Theo dõi khối lƣợng của lợn thí nghiệm đƣợc thực hiện tại cùng thời điểm trong ngày, trƣớc khi cho ăn, bắt đầu từ ngày tiêm (D0, lợn đƣợc 3 tuần tuổi) đến ngày thứ 84 sau khi tiêm (D84, lợn đƣợc 15 tuần tuổi). Kết quả theo dõi khối lƣợng của từng nhóm lợn đƣợc trình bày ở bảng 4.4 đến 4.6.
Bảng 4.4. Khối lƣợng của lợn sau tiêm vacxin thƣơng mại CircoFLEX
Số tai Khối lƣợng (kg) D0 D14 D28 D42 D56 D70 D84 RT4.1 5 6 9 12 19 24 35 RT4.2 4,5 6 14 13 18 29 43 RT4.3 4 5,5 11 16 17 33 31 RT4.4 5 7 10 17 16 33 48 RT4.5 5 8 9 18 27 33 62 RT4.6 4 7,5 11 17 23 41 51 RT4.7 6 5 7 17 25 35 48 RT4.8 5 4 12 17 26 29 43 RT4.9 6 7 7 17 24 37 46 RT4.10 5 7 10 17 30 32 44 Trung bình 4,95 6,30 10,00 16,10 22,50 32,60 45,10 Độ lệch chuẩn 0,69 1,23 2,16 1,97 4,74 4,67 8,49
Kết quả trình bày ở bảng 4.4 cho biết lợn ở lô tiêm vacxin thƣơng mại CircoFLEX tăng về khối lƣợng qua các thời điểm lấy mẫu: khối lƣợng trung bình từ 4,95 kg (D0, 3 tuần tuổi) tăng lên 45,10 kg (D84, 15 tuần tuổi). Tuy nhiên, chúng tôi cũng nhận thấy càng về giai đoạn sau (D56 đến D84) độ lệch chuẩn về khối lƣợng của lợn có sự dao động lớn, chứng tỏ càng về giai đoạn sau, sự biến động về khối lƣợng của lợn càng lớn.
Bảng 4.5. Khối lƣợng của lợn sau tiêm vacxin thử nghiệm CircoVNUA
Số tai Khối lƣợng (kg) D0 D14 D28 D42 D56 D70 D84 R2.1 4,5 6 10 13 19 24 36 R2.2 4,5 7 14 13 21 25 45 R2.3 5 7 11 13 27 37 46 R2.4 5 6 10 13 27 27 49 R2.5 4 7 10 15 25 29 55 R2.6 5,5 7 12 19 19 28 53 R2.7 5,5 6,5 8 22 23 35 47 R2.8 5 8 8 16 20 29 40 R2.9 5 7 8 17 27 36 36 R2.10 4,5 7,5 10 17 25 41 36 Trung bình 4,85 6,90 10,10 15,80 23,30 31,10 44,30 Độ lệch chuẩn 0,47 0,61 1,91 3,05 3,33 5,72 7,06
Kết quả ở bảng 4.5 cho thấy lợn ở lô tiêm vacxin thử nghiệm CircoVNUA chế từ các chủng PCV2 phân lập đƣợc ở Việt Nam có sự tăng về khối lƣợng qua các thời điểm lấy mẫu: khối lƣợng trung bình từ 4,85 kg (D0, 3 tuần tuổi) tăng lên 44,30 kg (D84, 15 tuần tuổi). Về giai đoạn sau (D70, D84) độ lệch chuẩn về khối lƣợng của lợn có sự dao động lớn (5,72 kg ÷ 7,06 kg), chứng tỏ sự biến động về khối lƣợng của lợn càng lớn. Nếu so sánh với độ lệch chuẩn của nhóm lợn đƣợc tiêm vacxin thƣơng mại CircoFLEX, chúng tôi thấy sự biến động ở lô lợn tiêm vacxin thử nghiệm là thấp hơn.
Kết quả theo dõi khối lƣợng của lợn lô đối chứng (không tiêm vacxin) đƣợc trình bày ở bảng 4.6.
Bảng 4.6. Khối lƣợng của lợn đối chứng
Số tai Khối lƣợng (kg) D0 D14 D28 D42 D56 D70 D84 RTD02.1 4 5 11 6 18 20 39 RTD02.2 5 7 11 8 13 25 44 RTD02.3 5 8 13 11 22 30 35 RTD02.4 5 7 12 17 25 30 30 RTD02.5 5,5 7 8 12 25 32 42 RTD02.6 5 8 8 12 22 35 43 RTD02.7 6 5,5 12 12 20 33 59 Trung bình 5,07 6,79 10,71 11,14 20,71 29,29 41,71 Độ lệch chuẩn 0,61 1,15 1,98 3,48 4,23 5,15 9,09
Kết quả trình bày ở bảng 4.6 cho thấy lợn ở lô đối chứng có sự tăng về khối lƣợng qua các thời điểm lấy mẫu: khối lƣợng trung bình từ 5,07 kg (D0, 3 tuần tuổi) tăng lên 41,71 kg (D84, 15 tuần tuổi). Về giá trị trung bình tại thời điểm 15 tuần tuổi, chúng tôi nhận thấy lợn ở lô đối chứng nặng 41,71 kg, trong khi đó ở các lô tiêm vacxin khối lƣợng của lợn trong khoảng 44,30 kg đến 45,10 kg. Cũng giống nhƣ nhận xét ở bảng 3.5 và bảng 3.6, chúng tôi cũng nhận thấy càng về giai đoạn sau (D56 đến D84) độ lệch chuẩn về khối lƣợng của lợn có sự dao động lớn, trong phạm vi từ 4,23 kg đến 9,09 kg. Điều này chứng tỏ có sự biến động lớn về khối lƣợng giữa các cá thể thuộc lô đối chứng. Số liệu trình bày đƣợc biểu diễn ở hình 4.4.
Hình 4.4. Diễn biến tăng khối lƣợng của lợn sau tiêm vacxin
Kết quả ở hình 4.4 cho thấy, tại thời điểm tiêm vacxin (D0) và đến thời điểm D28, sự sai khác về khối lƣợng giữa 3 nhóm lợn là rất nhỏ. Từ D42 đến D84, sự sai khác bắt đầu trở nên rõ rệt. Tuy nhiên, kết quả phân tích phƣơng sai một nhân tố cho thấy sự sai khác giữa 3 lô thí nghiệm là không có ý nghĩa thống kê (Fthực nghiệm = 0,37 < Flý thuyết = 3,44). Kết quả tính toán sự sai khác đƣợc trình bày ở bảng 4.7.
Bảng 4.7. Mức sai khác về khối lƣợng giữa các công thức thí nghiệm
Thời điểm
Mức chênh lệch (kg) giữa công thức thí nghiệm
*CircoFLEX/ **CircoVNUA *CircoFLEX/ **Đối chứng *CircoVNUA/ **Đối chứng D0 0,10 -0,12 -0,22 D14 -0,60 -0,49 0,11 D28 -0,10 -0,71 -0,61 D42 0,30 4,96 4,66 D56 -0,80 1,79 2,59 D70 1,50 3,31 1,81 D84 0,80 3,39 2,59
Ghi chú: giá trị sai khác mang dấu “-” xảy ra khi lợn ở công thức so sánh (*) có khối lượng nhỏ hơn khối lượng của lợn ở công thức được so sánh (**)
Kết quả trình bày ở bảng 4.7 cho thấy, từ ngày D0 – D28, sự sai khác về khối lƣợng giữa 3 nhóm là < 1 kg (0,10 kg ÷ 0,71 kg). Tuy nhiên, sau ngày D42 đến ngày D84, ở lô tiêm vacxin đều có khối lƣợng lớn hơn lô đối chứng từ 1,79
kg ÷ 4,96 kg (CircoFLEX so với đối chứng) và từ 1,81 kg ÷ 4,66 kg (CircoVNUA so với đối chứng). Sự sai khác về khối lƣợng giữa 2 lô tiêm vacxin (CircoFLEX so với CircoVNUA) dao động từ 0,30 kg ÷ 1,50 kg.
Theo dõi về mức độ đồng đều của lợn về khối lƣợng, chúng tôi chia các cá thể thành 2 nhóm: nhóm chậm lớn và nhóm bình thƣờng. Kết quả tổng hợp đƣợc trình bày ở bảng 4.8
Bảng 4.8. Kết quả theo dõi mức đồng đều về khối lƣợng
Thời điểm Lợn chậm lớn* (con) Lợn bình thƣờng (con) Circo FLEX Circo VNUA Đối chứng Circo FLEX Circo VNUA Đối chứng D0 0/10 0/10 0/7 10/10 10/10 7/7 D14 1/10 0/10 1/7 9/10 10/10 6/7 D28 2/10 0/10 2/7 8/10 10/10 5/7 D42 1/10 0/10 2/7 9/10 10/10 5/7 D56 1/10 0/10 1/7 9/10 10/10 6/7 D70 1/10 0/10 1/7 9/10 10/10 6/7 D84 1/10 0/10 1/7 9/10 10/10 6/7
Ghi chú: nhóm lợn chậm lớn (*) tại mỗi thời điểm cân là nhóm lợn có khối lượng nhỏ hơn 75% khối lượng trung bình của nhóm tại thời điểm đó
Kết quả trình bày ở bảng 4.8 cho thấy có từ 1-2 cá thể đƣợc đánh giá là chậm lớn ở nhóm lợn đƣợc tiêm vacxin CircoFLEX và nhóm đối chứng (không tiêm vacxin). Ở lô tiêm vacxin thử nghiệm, không có lợn nào đƣợc đánh giá là chậm lớn trong suốt quá trình theo dõi. Tại thời điểm 15 tuần tuổi, lợn đƣợc đánh giá chậm lớn ở lô vacxin CircoFLEX là 31,0 kg (trung bình nhóm là 45,1 kg), ở lô đối chứng là 30,0 kg (trung bình nhóm là 41,71 kg).
Nhƣ vậy, với các kết quả trình bày chúng tôi thấy rằng về giá trị trung bình, lợn đƣợc tiêm vacxin thử nghiệm có khối lƣợng cao hơn so với lợn không đƣợc tiêm vacxin. Tuy nhiên, sự sai khác này là không có ý nghĩa thống kê. Không có cá thể nào đƣợc đánh giá là chậm lớn ở lô tiêm vacxin CircoVNUA thử nghiệm.
4.2.1.2. Kết quả nghiên cứu triệu chứng, bệnh tích đại thể và vi thể của lợn được tiêm vacxin
Đồng thời với theo dõi khối lƣợng, chúng tôi tiến hành theo dõi biểu hiện lâm sàng của lợn trƣớc/ trong/ sau tiêm vacxin. Chúng tôi theo dõi lợn trong vòng 1 tuần trƣớc khi tiêm vacxin và không quan sát đƣợc những bất thƣờng của lợn về
các tình trạng: hô hấp, tiêu hóa, thân nhiệt. Lợn không có các triệu chứng nào bất thƣờng, thân nhiệt của lợn cũng ổn định dao động từ 39,3 ± 0,3 oC - là nhiệt độ thân nhiệt của lợn khỏe mạnh bình thƣờng. Trong quá trình tiêm vacxin, không có