Dòng/giống Kiểu gen Ph3 Nơi thu thập
CLN2037B Ph3/Ph3 AVRDC L3708 Ph3/Ph3 AVRDC 08TP73-10-4 Ph3/Ph3 FAVRI 08TP85-2-3-10-1-1-1-6-3 Ph3/Ph3 FAVRI (08TP76 X 08TP65)5-3-7-3-3-1-1 Ph3/Ph3 FAVRI 08TP85-2-3-10-1-1-1-7-2 Ph3/Ph3 FAVRI 08TP85-2-3-5-1-1-1-10 Ph3/Ph3 FAVRI 08TP85-2-3-5-1-6-2-4 Ph3/Ph3 FAVRI
Hồng đào Ph3/ph3 Công ty Sygenta 08TP03-15-3-1 ph3/ph3 FAVRI 08TP86B-4-5-8-6-5-1 ph3/ph3 FAVRI
AVTO-9803-5 ph3/ph3 FAVRI
11FAV-10-3 ph3/ph3 FAVRI
PT18 ph3/ph3 FAVRI
Anna ph3/ph3 Công ty Seminis Savior ph3/ph3 Công ty Sygenta Nguồn: DNA này sẽ được dùng để khảo sát các chỉ thị phân tử liên kết với gen Ph3
kháng bệnh sương mai b.Chỉ thị phân tử
Sử dụng 5 chỉ thị phân tử đã được xác định từ các nghiên cứu trước đó bao gồm TOM236 (Zhu et al., 2006), SCU602F3R3 (Trương Thị Hồng Hải và cs, 2015) và 3 chỉ thị còn lại là SSR383, SSR69, LB3 (Kết quả đề tài, 2009- 2012). Các chỉ thị lựa chọn tập trung trên vai dài nhiễm sắc thể số 9, gần vị trí chỉ thị TG591 (chỉ thị RFLP).
Hình 3.1. Vùng khảo sát chỉ thị phân tử liên kết với gen Ph3 trên nhiễm sắc thể số 9
c. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Tách chiết DNA được thực hiện sử dụng mẫu lá non giai đoạn 2 đến 3 lá thật phục vụ xác định chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen Ph3, theo phương pháp của Dorokhov and Klocke (1998), có cải tiến.
Định tính DNA bằng phương pháp điện di
Để kiểm tra độ tinh sạch của DNA, tiến hành điện di trên gel agarose 1%. Dưới tác dụng của điện trường, do tích điện âm nên DNA di chuyển từ cực âm sang cực dương. Đoạn DNA nào lớn thì di chuyển chậm, ngược lại đoạn DNA ngắn sẽ di chuyển nhanh và tách nhau ra. Do đó có thể phân tách được các đoạn DNA trong hỗn trên gel agarose.
d. Thực hiện phản ứng PCR với các cặp mồi liên kết với gen Ph3 kháng bệnh sương mai và các mẫu giống khác nhau
Phản ứng PCR qua 5 chỉ thị nghiên cứu xác định trên các mẫu giống được liệt kê trong bảng 3.1. Thành phần mỗi phản ứng 10µl như bảng 3.2 dưới đây: