Nguồn nấm bệnh:
Sử dụng chủng phân lập RIFAV, thu thập tại khu ruộng thí nghiệm của Viện Nghiên Cứu Rau Quả, Gia Lâm- Hà Nội, vụ Đông Xuân 2017. Lá bệnh điển hình được thu thập và phân lập theo phương pháp của Caten và Jinks (1968) có cải tiến trên môi trường V8.
A B C
Hình 3. 4. Quá trình phân lập nấm sương mai (A-mẫu bệnh, B- Phân lập trên môi trường V8, C- Hình dạng bọc bào tử động dưới kính hiển vi)
Sau phân lập, nguồn bệnh được kiểm tra lại qua xác định hình thái bọc bào tử động dưới kính hiển vi. Để duy trì tính độc cao các isolate nấm liên tục được lưu trên mẫu lá cà chua tươi ở nhiệt độ 170C – 180C.
3.5.2. Phương pháp xác định kiểu gen Ph3 của các tổ hợp lai cà chua
Sử dụng chỉ thị phân tử LB3 liên kết chặt nhất với gen Ph3 thu được từ thí nghiệm trên để xác định kiểu gen Ph3 của các tổ hợp lai cà chua sau:
Bảng 3. 4. Các tổ hợp lai cà chua tiến hành xác định kiểu gen Ph3
TT Ký
hiệu Tên giống/tổ hợp lai Nơi thu thập
1(Đ/C) V1 Savior Công ty Sygenta
2 V2 08TP85-2-3-10-1-1-1-6-3 x (08TP76 X 08TP65)5-3-7-3-3-1-1 FAVRI 3 V3 08TP85-2-3-10-1-1-1-7-2 x AVTO-9803-5 FAVRI 4 V4 08TP85-2-3-5-1-1-1-10 x 11FAV-10-3 FAVRI 5 V5 08TP85-2-3-5-1-6-2-4 x 08TP86B-4-5-8-6-5-1 FAVRI
Gieo hạt trong nhà lưới đến khi cây có 5-6 lá thật tiến hành tách chiết DNA, điều tra khả năng chứa gen Ph3, đồng thời tiến hành lây nhiêm nhẫn tạo sử dụng chủng phân lập trên.
3.5.3. Đánh giá năng suất, đặc điểm nông sinh học và tình hình sâu bệnh của các tổ hợp lai cà chua ở vụ Xuân Hè năm 2017 tại Gia Lâm- Hà Nội các tổ hợp lai cà chua ở vụ Xuân Hè năm 2017 tại Gia Lâm- Hà Nội
Các tổ hợp lai đã được xác định kiểu gen Ph3 trong thí nghiệm trên được tiến hành so sánh đánh giá về năng suất, đặc điểm nông sinh học và tình hình sâu bệnh hại ở vụ Xuân Hè năm 2017. Bố trí thí nghiệm, một số chỉ tiêu theo dõi theo QCVN 01-63:2011/BNNPTNT. Bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh, 3 lần nhắc lại, 5 tổ hợp lai ký hiệu từ V1 đến V5 (trong đó V1 là giống lai F1 Savior làm đối chứng). Gieo hạt ngày 5 tháng 2 năm 2017 trên khay (40 x 60 cm) với giá thể sạch GT05 trộn với xơ dừa theo tỷ lệ 1:1, mỗi khay có 40 đến 50 lỗ. Giữ ẩm thường xuyên, đặt khay cây gieo trong nhà lưới tránh côn trùng, che mưa. Trồng ra ruộng khi cây con có từ 5 đến 6 lá thật. Thí nghiệm đặt tại Viện Nghiên cứu Rau quả, đại diện vùng Đồng bằng sông Hồng. Luống rộng 1,5 m kể cả rãnh, cao 20 cm. Trồng hàng đôi trên luống,
hàng x hàng 65 cm, cây x cây 40 cm. Mỗi ô thí nghiệm trồng 40 cây, mật độ khoảng 2,8 vạn cây/ha. Bón lót 100% phân hữu cơ, 100% phân lân, 1/3 phân đạm và 1/3 phân kali. Lượng đạm và kali còn lại chia đều khi bón thúc vào ba lần kết hợp với xới vun.
Theo dõi đánh giá các tính trạng nông sinh học
- Theo dõi đặc điểm về chỉ tiêu sinh trưởng của cây:
+ Chiều cao cây cuối cùng (cm): Đo tính từ cổ rễ đến đỉnh sinh trưởng cây. + Dạng hình sinh trưởng: Tùy theo khả năng sinh trưởng mà chia thành các dạng hình sinh trưởng bán hữu hạn, hữu hạn và vô hạn.
- Theo dõi các đặc điểm hình thái và phẩm chất quả:
+ Chiều cao quả (mm) (H): Đo bằng thước kẹp của 10 quả trung bình. + Đường kính quả (mm) (D): Đo bằng thước kẹp tại vị trí to nhất của 10 quả trung bình.
+ Độ dày thịt quả (mm): Đo từ vỏ đến chỗ tiếp xúc ngăn hạt tại phần lớn nhất của quả, quả lấy từ chùm quả 2 đến chùm quả 3. Số quả mẫu: 10 quả/ lần nhắc (bằng thước panme).
+ Độ Brix (%): Đo bằng chiết quang kế.
+ Số ngăn hạt trên quả: Đo 10 quả tính trung bình.
+ Hình dạng quả được xác định thông qua chỉ số hình dạng quả và tính theo công thức: I = H/D, trong đó: I là chỉ số hình dạng quả, H: Chiều cao quả và D: Đường kính quả. Dựa vào chỉ số hình dạng quả có thể chia thành 3 dạng quả: I > 1,1: Dạng quả dài, I = 0,8- 1,1: Dạng quả tròn và I < 0,8: Dạng quả dẹt.
+ Màu sắc quả khi chín: Vàng, đỏ vàng, đỏ bình thường, đỏ cờ, đỏ thẫm. - Các yếu tố cấu thành năng suất bao gồm:
+ Khối lượng trung bình quả (g): Số quả mẫu 5 quả/ lần nhắc lại.
+ Năng suất thực thu (tấn/ha): Tổng khối lượng quả đến khi kết thúc thu hoạch trên 1 đơn vị diện tích (Thu hoạch khi quả chín).
+ Năng suất thương phẩm (tấn/ha): Tổng khối lượng quả thương phẩm thu được đến khi kết thúc thu hoạch trên 1 đơn vị diện tích (Quả thương phẩm được đánh giá dựa vào TCVN 4845: 2007 về quả cà chua tươi).
Đánh giá tình hình nhiễm sâu bệnh ngoài đồng
Đánh giá bệnh sương mai và xoăn vàng lá theo quy chuẩn quốc gia QCVN 01-63:2011/BNNPTNT về khảo nghiệm giá trị canh tác và sử dụng giống cà chua như sau:
- Bệnh sương mai (Phytophthora infestans Debary): Giai đoạn sau trồng 30, 60 và 90 ngày. Tiến hành quan sát mức độ nhiễm bệnh trên thân lá theo thang điểm dưới đây: Điểm 1: Không bệnh; Điểm 3: Có dưới 20% diện tích thân lá nhiễm bệnh; Điểm 5: Có 20% đến 50% diện tích trên thân lá nhiễm bệnh; Điểm 7: Có trên 50% đến 75% diện tích thân lá nhiễm bệnh; Điểm 9: Có trên 75% đến 100% diện tích thân lá nhiễm bệnh.
- Bệnh xoăn vàng lá: Giai đoạn đánh giá từ trồng đến thu hoạch. Tiến hành đếm số cây có triệu chứng bệnh, tính tỷ lệ % cây bệnh (%).
3.5.4. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lí bằng phần mềm Microsoft Excel và xử lý thống kê với chương trình phần mềm xử lý thống kê SAS 9.1.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT SỰ ĐA HÌNH VỚI GEN Ph3 CỦA CÁC CHỈ
THỊ PHÂN TỬ
Khảo sát sự đa hình của 5 chỉ thị phân tử được biết có liên kết với gen Ph3
là: TOM236, SSR383, SSR69, LB3 và SCU602F3R3. 16 mẫu dòng/giống dùng để xác định sự đa hình của 5 chỉ thị phân tử bao gồm 9 mẫu giống có chứa gen kháng bệnh Ph3 là L3708, CLN2037B, 08TP73-10-4, 08TP85-2-3-10-1-1-1-6-3, 08TP85-2-3-10-1-1-1-7-2, 08TP85-2-3-5-1-1-1-10, 08TP85-2-3-5-1-6-2-4, (08TP76 X 08TP65)5-3-7-3-3-1-1 và Hồng đào; 7 mẫu giống không chứa gen kháng Ph3, nhiễm bệnh sương mai là Anna, Savior, 08TP03-15-3-1, AVTO- 9803-5, 11FAV-10-3, 08TP86B-4-5-8-6-5-1 và PT18. Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 4.1.
Bảng 4.1. Đặc điểm các chỉ thị phân tử thể hiện tính đa hình với gen Ph3
Tên chỉ thị Trình tự Tm (0C) Kích thước (bp) Kháng Nhiễm TOM236 5’-GTTTTTTCAACATCAAAGAGCT-3’ 45 155 185 3’-GGATAGGTTTCGTTAGTGAACT-5’ SSR383 5’-ATTGTACAAAGACCCGTGGC-3’ 64 230 188 3’-GTTGCACACTGGATCAATGC-5’ SSR69 5’-TTGGCTGGATTATTCCTGTTG-3’ 64 127 145 3’-GCATTTGATAGAAGGCCAGC-5’
LB3 5’-GGT GAT CTG CAA ATA GAC TTG GG-3’ 55 249 482 3’-AAG GTC TAA AGA AGG CCC GTG C-5’
SCU602F3R3 5’-ACAAACTAAATGTACAAGTG-3’
3’-ATGATATATCTTCTCGGGA-5’ 55 400 450
Sản phẩm điện di sau khi thực hiện PCR bảng 4.1 cho thấy: với chỉ thị TOM 236 cho sản phẩm là vạch băng kháng có kích thước 155 bp trên các mẫu giống chứa gen kháng Ph3, kháng bệnh sương mai, và băng nhiễm có kích thước
185 bp trên các mẫu giống không chứa gen Ph3, nhiễm bệnh sương mai. Tương tự như vậy với các chỉ thị SSR383 (kháng 230 bp, nhiễm 188 bp, hình 4.2.), SSR69 (kháng 127 bp, nhiễm 145 bp, hình 4.3.), LB3 (kháng 249 bp, nhiễm 482 bp, hình 4.4.), SCU602F3R3 (kháng 400 bp, nhiễm 450 bp, hình 4.5.). Kết quả này khẳng định gen Ph3 định vị trên nhiễm sắc thể số 9, khu vực vai dài. Chungwonse et al. (1998) khi nghiên cứu lập bản đồ gen Ph3 và Zhu et al.
(2006) khi nghiên cứu xác định chỉ thị SSR liên kết với gen kháng bệnh sương mai trên cà chua cũng có kết quả tương tự như đánh giá của chúng tôi.
Hình 4.1. Ảnh điện di sản phẩm PCR của chỉ thị TOM 236
Ghi chú: Giếng 1, 2, 3, 4 và 5 có vạch băng dài 155 bp lần lượt là của mẫu giống L3708, CLN2037B,
08TP85-2-3-10-1-1-1-6-3, 08TP85-2-3-10-1-1-1-7-2 và 08TP85-2-3-5-1-6-2-4, chứa gen kháng Ph3 và
kháng bệnh; Giếng 6,7,8 và 9 có vạch băng dài 185 bp, lần lượt của các mẫu giống: Anna, Savior,
AVTO-9803-5 và PT18 không chứa gen kháng Ph3 và nhiễm bệnh; Giếng 10 (đối chứng nước cất).
Hình 4.2. Ảnh điện di sản phẩm PCR của chỉ thị SSR383
Ghi chú: Giếng 1 và 2 có vạch băng dài 230 bp là mẫu giống L3708 và CLN2037B, chứa gen kháng Ph3
vàkháng bệnh; Giếng 3,4 và 5 có vạch băng dài 188 bp, thuộc các cây của mẫu giống: Anna, Savior và
Ladder 1 2 3 4 127 bp 145 bp 150 bp 100 bp Hình 4.3. Ảnh điện di sản phẩm PCR của chỉ thị SSR69
Ghi chú: Giếng 1, 2 có vạch băng dài 127 bp là của mẫu giống L3708, và CLN2037B, chứa gen kháng
Ph3 vàkháng bệnh; Giếng 3 có vạch băng dài 145 bp, thuộc các cây của mẫu giống PT18, không mang
gen kháng Ph3 và nhiễm bệnh.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Hình 4. 4. Ảnh điện di sản phẩm PCR của chỉ thị LB3
Ghi chú: Giếng 4 đến 9 có vạch băng dài 249 bp là các mẫu giống lần lượt là L3708, CLN2037B, 08TP73-10-4, 08TP85-2-3-10-1-1-1-6-3, 08TP85-2-3-10-1-1-1-7-2 và 08TP85-2-3-5-1-1-1-10, chứa gen
kháng Ph3 vàkháng bệnh; Giếng 1- 3 có vạch băng dài 482 bp, thuộc mẫu giống: Anna, Savior và PT18,
không mang gen kháng Ph3 và nhiễm bệnh.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Hình 4. 5. Ảnh điện di sản phẩm PCR của chỉ thị SCU602F3R3
Ghi chú: M thang chuẩn 100 bp; Giếng 1, 7, 14 có vạch băng dài 400 bp là của các mẫu giống
L3708, CLN2037B và 08TP73-10-4 chứa gen kháng Ph3, kháng bệnh; Giếng 2, 3, 9, 10, 12, 17 có băng
dài 450 bp là các mẫu dòng/giống Anna, Savior, 08TP03-15-3-1, AVTO-9803-5, 11FAV-10-3, 08TP86B-
4-5-8-6-5-1 và PT18, không mang gen kháng Ph3 và nhiễm bệnh; Các giếng 4,5,6,8, 11,13,15,16 có 2
băng 400 và 450 bp là mẫu giống Hồng đào chứa gen kháng Ph3 ở trạng thái dị hợp tử và kháng bệnh.
Kết quả cho thấy, cả năm chỉ thị được tiến hành khảo sát trên đều liên kết với gen Ph3 kháng bệnh sương mai nhờ cho sản phẩm PCR với vạch băng sáng và rõ. Năm chỉ thị nghiên cứu đều thuộc những chỉ thị nhân DNA dựa trên cơ sở PCR, phân biệt rõ được mẫu giống chứa gen kháng Ph3, kháng được bệnh và phân biệt được với các dòng không chứa gen Ph3, bị nhiễm bệnh. Như vậy, 5 chỉ thị khảo sát trên đều thể hiện tính đa hình với gen Ph3
giữa vật liệu thí nghiệm của đề tài. Điều này cũng phù hợp với kết quả của các nghiên cứu đi trước.
Tuy nhiên, ứng dụng chỉ thị nào trong chọn lọc gen Ph3 một cách chính xác thì cần phải xác định lại mức độ liên kết của từng chỉ thị với gen Ph3 được thể hiện thông qua điều tra kiểu gen bằng chỉ thị phân tử và kiểu hình bằng lây nhiễm nhân tạo các cây trong quần thể F2. của tổ hợp lai giữa mẫu giống kháng chứa gen Ph3 với mẫu giống nhiễm, không chứa gen Ph3.
4.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ LIÊN KẾT CỦA CHỈ THỊ PHÂN TỬ THÔNG QUA ĐÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG ĐỒNG GIỮA KIỂU GEN VÀ THÔNG QUA ĐÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG ĐỒNG GIỮA KIỂU GEN VÀ KIỂU HÌNH TÍNH KHÁNG BỆNH
Để nghiên cứu khoảng cách di truyền giữa một chỉ thị liên kết với một gen nào đó, người ta có thể sử dụng quần thể F2 lai giữa giống có chứa gen kháng, kháng bệnh với giống không chứa gen kháng và nhiễm bệnh. Cũng có thể sử dụng quần thể BC1F1 là kết quả lai lại giữa cây F1 chứa gen kháng dị hợp tử với bố mẹ không chứa gen kháng nhiễm bệnh. Tuy nhiên, để tiết kiệm thời gian trong chọn tạo giống người ta thường sử dụng quần thể F2 để điều tra. Như vậy không cần phải chờ quá trình lai lại để có thế hệ phân ly BC1F1. Trong nghiên cứu này 96 cây chọn ngẫu nhiên từ quần thể F2 của tổ hợp lai 08TP03-15-3-1 × 08TP73- 10-4 được dùng để xác định chỉ thị liên kết chặt với gen kháng Ph3 thông qua tỷ lệ cây có chứa giao tử trao đổi chéo. Xác định khả năng chứa gen Ph3 hay không thông qua phân tích bằng chỉ thị phân tử và tính kháng nhiễm được đánh giá thông qua lây nhiễm nhân tạo.
Kết quả phân tích kiểu gen Ph3 kết hợp với đánh giá tính kháng/ nhiễm của các cá thể trong quần thể F2 được trình bày trong bảng 4.2. .
Bảng 4.2. Kiểu hình, kiểu gen và trao đổi chéo của quần thể F2 của tổ hợp lai 08TP03-15-3-1 × 08TP73-10-4 Cá thể Số bào tử tạo ra (*) Kiểu hình Kiểu gen LB3 (bp) TOM236 (bp) SSR69 (bp) SSR383 (bp) SCU602F3R3 (bp) 1 32,0 S - 482 185 145 188 450 2 2,0 H +/- 249/482 155/185 127/145 230/188 400/450 3 3,0 H +/- 249/482 155/185 127/145 230/188 400/450 4 2,0 H +/- 249/482 155/185 127/145 230/188 400/450 5 1,0 R + 249 155 127 230 400 6 1,0 R + 249 155 127 230 400 7 2,0 H +/- 249/482 155/185 127 230/188 400/450 8 37,5 S - 482 185 145 188 450 9 9,0 H +/- 249/482 155/185 127/145 230/188 400/450 10 12,5 S - 482 185 145 188 450 11 0,5 R + 249 155 127 230 400 12 2,0 H +/- 249/482 155/185 127/145 230/188 400/450 13 4,5 H +/- 249/482 155/185 127/145 230/188 400/450 14 0,5 R + 249 155 127 230/188 400 15 7,0 H +/- 249/482 155/185 127/145 230/188 400/450 16 1,0 R + 249 155 127 230 400 17 1,5 H +/- 249/482 155/185 127/145 230/188 400/450 18 9,5 H +/- 249/482 155/185 127/145 230/188 400/450 19 5,0 H +/- 249/482 155/185 127/145 230/188 400/450 20 3,5 H +/- 249/482 155/185 127/145 230/188 400/450 21 1,5 H +/- 249/482 155/185 127 230/188 400/450
Cá thể Số bào tử tạo ra (*) Kiểu hình Kiểu gen LB3 (bp) TOM236 (bp) SSR69 (bp) SSR383 (bp) SCU602F3R3 (bp) 22 8,5 H +/- 249/482 155/185 127/145 230/188 400/450 23 6,0 H +/- 249/482 155/185 127/145 230/188 400/450 24 18,5 S - 482 185 145 188 450 25 0,5 R + 249 155 127 230 400 26 10,5 S - 482 185 127/145 230/188 450 27 14,5 S - 482 185 145 188 450 28 0,5 R + 249 155 127 230 400 29 4,5 H +/- 249/482 155/185 127/145 230/188 400/450 30 1,5 H +/- 249/482 155/185 127/145 230/188 400/450 33 40,0 S - 482 185 145 188 450 32 0,5 R + 249 155 127 230 400 33 1,5 H +/- 249/482 155/185 127/145 230/188 400/450 34 2,5 H +/- 249/482 155/185 127/145 230/188 400/450