Kết quả cuối cùng là một đoạn mã hóa di truyền đặc biệt nào đó được khuếch đại lên rất nhiều lần. Sự khuếch đại này có thể được tính như sau
Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2n (m: là số bản sao của chuỗi mã hóa; n: là số chu kỳ).
Chỉ thị SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions- Kỹ thuật nhân bản vùng chuỗi được mô tả (Park et al., 2010).
Chỉ thị SCAR là kỹ thuật nhân DNA bằng PCR tạo ra các đoạn DNA tại những locus nhất định sử dụng các mồi đặc thù. SCAR được tiến hành bằng cách tách dòng sản phẩm PCR với các mồi ngẫu nhiên sau đó đọc trình tự hai đầu đoạn tách dòng. Dựa vào trình tự hai đầu này để thiết kế cặp mồi với độ dài 15 đến 30bp để nhân băng đơn với kích thước tương tự như phân đoạn được nhân dòng. Sự đa hình được xác định bằng sự có mặt hay vắng mặt của băng được nhân bản hoặc sự xuất hiện đa hình về chiều dài đồng thời chuyển chỉ thị trội thành chỉ thị SCAR đồng trội.
Kỹ thuật SCAR được dùng để phân tích thư viện genome, xác định các locus gen đặc thù và chọn giống nhờ chỉ thị phân tử.
Chỉ thị RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNAs- Đa hình các đoạn DNA khuếch đại dùng mồi đơn ngắn ngẫu nhiên) (Nguyễn Đức Thành, 2014)
Cơ sở của kỹ thuật RAPD là nhân bản DNA genome bằng phản ứng PCR dùng các mồi đơn ngẫu nhiên, ngắn (thường dưới 10 nucleotide) để tạo ra sự đa hình các đoạn DNA. Trình tự mồi RAPD là ngẫu nhiên với tỷ lệ GC tối thiểu là 40% (thường 50-80%), không có trình tự bazơ đầu xuôi và ngược giống nhau. Sản phẩm PCR- RAPD thường được phân tách trên gel agarose 1,5- 2,0%. Kỹ thuật RAPD đơn giản, dễ thực hiện và không cần thông tin về genome của đối tượng nghiên cứu, có thể ứng dụng cho các loài khác nhau với các mồi chung. Hạn chế của kỹ thuật RAPD là sản phẩm PCR không ổn định, tạo ra các chỉ thị trội, không phân biệt được các cá thể dị hợp tử và đồng hợp tử.
RAPD sử dụng nhiều trong nghiên cứu đa dạng di truyền, đặc điểm của giống và đánh giá biến đổi di truyền, trong xác định loài và xác định con lai.
Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism- Kỹ thuật đa hình độ dài đoạn nhân chọn lọc) (Nguyễn Đức Thành, 2014)
được kết hợp cả RFLP và PCR bằng việc gắn các chuỗi nhận biết vào mồi để nhân chọn lọc các đoạn DNA được cắt hạn chế. Các cặp mồi thường tạo được từ 50-100 băng trong một phân tích. Số lượng băng phụ thuộc vào số nucleotide chọn lọc trong tổ hợp mồi. Kỹ thuật AFLP cho phép lấy DNA từ bất kỳ nguồn gốc nào.
Phân tích AFLP hiệu quả với một số ưu điểm như: độ tin cậy và lặp lại cao; không cần thông tin về trình tự DNA của sinh vật nghiên cứu; khả năng phân tích số lượng lớn locus đa hình với một tổ hợp một trên một gel và có thể cho thấy các locus đặc thù; các số liệu có thể lưu giữ trong cơ sở dữ liệu để so sánh. Tuy nhiên, AFLP phải trải qua nhiều bước; DNA cần phải sạch, không có các chất ức chế hoạt động của enzyme cắt hạn chế; đòi hỏi công sức và giá thành cao. Kỹ thuật tạo ra chỉ thị trội, không phân biệt được đồng hợp tử và dị hợp tử.
AFLP được sử dụng trong nghiên cứu lập bản đồ gen, đa dạng di truyền, nghiên cứu quan hệ họ hàng giữa các kiểu gen có quan hệ gần, nghiên cứu cấu trúc di truyền nguồn gen và đánh giá phân hóa di truyền trong quần thể.
2.3.1.3. Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại
Chuỗi lặp lại có trật tự (Tandemly Repeated Sequence) là những trình tự lặp lại một cách có trật tự từ đầu đến cuối trong một hệ gen, thường được gọi là DNA vệ tinh, tiểu vệ tinh hay vi vệ tinh tuỳ thuộc vào số lượng bản sao của chúng trong hệ gen và tính chất của chuỗi.
Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats- Sự lặp lại các trình tự đơn giản)
Chỉ thị này được phát triển bởi Litt và Luty năm 1989, là những đoạn DNA lặp lại một cách có trật tự, gồm những đơn vị lặp lại từ 2-6 nucleotide, theo kiểu lặp lại ngắn và vài chục lần. Các trình tự này tồn tại trong cơ thể sinh vật Eukaryote khá phổ biến, tùy từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ 2 đến hàng trăm ngàn lần hoặc nhiều hơn (Lê Thị Ánh Hồng, 2002).
Ưu điểm của chỉ thị SSR là dễ thực hiện, không tốn kém. SSR là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện đa hình rất cao, nhưng quá trình thiết kế mồi rất tốn kém mà mỗi loại mồi chỉ đặc trưng cho một loài. Tuy nhiên, SSR là một loại chỉ thị chính xác và hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại giống vật nuôi, cây trồng khác nhau trong cùng một loài động hay thực vật. Người ta sử dụng chỉ thị SSR để phân tích hệ gen, xây dựng bản đồ liên kết gen, trong chọn lọc tính kháng bệnh, nghiên cứu một số tính trạng liên quan đến năng suất cây
trồng, bệnh hại và sử dụng trong việc phân định sự sai khác giữa các giống trong cùng một loài phụ do khả năng cho phép đánh giá mức độ allen thuộc một locus.
Chỉ thị dựa trên các trình tự microsatellite cụ thể ở từng locus từ nhiều loài như xà lách (Lactuca sativa L.), đại mạch (Hordeum vulgare L.), và lúa gạo (Oryza Sativa L.)... đã được công bố (Park et al., 2010).
Tiểu vệ tinh (Minisatellite)
Tiểu vệ tinh là loại chuỗi lặp lại nhiều lần, có đơn vị lặp lại gồm từ 6 nucleotide trở lên (thường vào khoảng 15 bp), bao phủ một vùng từ 0,5-3 kb. Không giống như DNA vệ tinh, tiểu vệ tinh được tìm thấy ở những vùng dị nhiễm sắc và thường thay đổi rất nhiều về kích thước (Armour and Jeffreys, 1992). Có 2 loại DNA tiểu vệ tinh. Đó là DNA đầu mút nhiễm sắc thể và DNA tiểu vệ tinh siêu biến. DNA đầu mút nhiễm sắc thể nằm ở vai nhiễm sắc thể, gồm một vài kilobase. DNA tiểu vệ tinh siêu biến nằm ở vùng phụ đầu mút nhiễm sắc thể (Napvi et al., 1995).
2.3.2. Ứng dụng của chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây trồng
Trong nông nghiệp, mục tiêu chính của các nhà chọn tạo giống cây trồng truyền thống là cải thiện các giống cây trồng hiện có, đưa nguồn gen mới có tính trạng mong muốn vào một giống khác bằng phương pháp lai trở lại liên tục, chọn lọc các cá thể ưu tú trong quần thể phân ly từ thế hệ F2 đến các thế hệ tiếp theo. Phương pháp này rất tốn kém, mất nhiều thời gian và chịu tác động của yếu tố môi trường. Sự ra đời của công nghệ chỉ thị DNA, chiến lược chọn giống nhờ chỉ thị phân tử đã giúp các nhà chọn giống thực vật và nhà di truyền học vượt qua nhiều vấn đề phải đối mặt trong chọn tạo giống truyền thống, chọn lọc một cách chính xác và hiệu quả hơn (Winter amd Kahl, 1995).
Chỉ thị phân tử hiện nay đã được sử dụng rộng rãi để theo dõi các locus và các vùng genome trong một vài chương trình chọn tạo giống cây trồng, như chỉ thị phân tử liên kết chặt với một số lượng lớn các tính trạng nông học và tính kháng bệnh có sẵn ở các loài cây trồng chính. Trong đó, chỉ thị DNA được tạo ra với số lượng lớn và rất hữu ích trong việc cải thiện giống cây trồng. Chẳng hạn, những chỉ thị này đã được sử dụng rộng rãi để xây dựng bản đồ phân tử. Sự liên kết của chúng với các gen/QTL kiểm soát các tính trạng kinh tế quan trọng cũng có thể được sử dụng trong một vài trường hợp gián tiếp chọn tạo giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) (Winter and Kahl, 1995).
Chỉ thị DNA cho phép nghiên cứu những biến đổi trong vật liệu di truyền của cơ thể sống ở cấp độ DNA. Ngoài việc ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền, trên cơ sở phân loại định danh và xác định kiểu gen của cá thể; chỉ thị DNA còn giúp nhà chọn giống xác định nhanh, sớm và chính xác bản chất di truyền của đối tượng cần chọn giống (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005).
Cùng với sự tiến bộ của Công nghệ sinh học hiện đại đã phát hiện ra các chỉ thị về DNA đã trở thành công cụ đắc lực giúp các nhà di truyền chọn giống nghiên cứu một cách có hiệu quả về biến đổi di truyền trong quần thể tự nhiên, xác định mối quan hệ giữa các cá thể trong cùng một loài hoặc giữa các loài, là cơ sở cho việc phân loại dưới loài, phát hiện loài mới và quan hệ tiến hóa giữa loài và những nghiên cứu chi tiết hơn phát hiện những thay đổi trong genome (Trần Thị Hòa và Luduwig Triest, 2000). Một vài ứng dụng khác của chỉ thị phân tử bao gồm sự du nhập gen thông qua quá trình lai lại, sự di truyền đặc tính, chẩn đoán di truyền, nghiên cứu tổ chức genome và phân tích sự phát sinh loài. Ứng dụng trong chọn tạo giống thực vật, chỉ thị SSR đã được chứng minh và đề xuất như là sự lựa chọn của các chỉ thị trong số các chỉ thị phân tử hiện nay (Winter and Kahl, 1995).
2.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ TÍNH KHÁNG BỆNH SƯƠNG MAI VÀ CHỌN TẠO GIỐNG CÀ CHUA KHÁNG BỆNH VÀ CHỌN TẠO GIỐNG CÀ CHUA KHÁNG BỆNH
2.4.1. Các nghiên cứu ngoài nước
Tính kháng bệnh sương mai ở cà chua đã được phát hiện do 3 gen kháng chính quy định, hiện đang có ở các loài cà chua hoang dại quả đỏ S. pimpinellifolium, bao gồm Ph1, Ph2 và Ph3, lần lượt nằm trên các nhiễm sắc thể cà chua số 7, số 10 và số 9. Gen kháng Ph1 là gen trội có khả năng kháng chuyên tính với chủng T-0, nhưng nhanh chóng bị vượt qua bởi sự xuất hiện chủng mới của mầm bệnh. Gần đây, nấm Phytophthora infestans đang xuất hiện tồn tại chủng T-1 chiếm ưu thế, làm cho khả năng kháng của gen Ph1 không còn hiệu quả. Gen trội không hoàn toàn Ph2 cung cấp tính kháng từng phần với một số isolate của chủng T-1. Gen kháng Ph2 làm chậm nhưng không ngừng được sự phát triển của nấm bệnh. Hơn nữa, gen Ph2 thường mất tính kháng khi có sự xuất hiện của một số chủng mới linh hoạt hơn. Gen Ph2 đã được định vị nằm giữa hai chỉ thị RFLP là CP105 và TG233 ở khoảng 8.4 cM. Một gen kháng mạnh hơn là
Ph3, đã được phát hiện ở loài cà chua S. pimpinellifolium trong dòng L3707 và L3708 đang bảo tồn tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Rau Châu Á. Hiện
nay, gen này kháng hữu ích hơn nhiều so với các gen Ph1 và Ph2, mang lại tính kháng trội không hoàn toàn trên diện rộng đối với các chủng Phytophthhora
infestans của cà chua. Gen Ph3 đã được định vị nằm gần chỉ thị RFLP TG591a
(Dilip et al., 2015). Gen Ph3 trội không hoàn toàn, kháng tốt với chủng Pi-16, trong khi đó các gen kháng Ph1 và Ph2 không thể hiện tính kháng với chủng này. Giống cà chua mang gen kháng Ph1 hay Ph2 không thể hiện khả năng kháng tốt đối với các chủng nấm sương mai tại Israel (Davis et al., 1996). Điều này chứng tỏ các gen trên chỉ mang tính kháng chuyên tính với một hoặc một số chủng
Phytophthora infestans nhất định. Trái lại, do nấm bệnh này có khả năng sinh sản
hữu tính tạo ra các dạng tái tổ hợp mới rất nhanh chóng nên giống cà chua mang gen kháng trên rất dễ bị nhiễm bệnh bởi các chủng mới. Ngay sau đó, nghiên cứu của Chen et al. (2008) chỉ ra rằng “Ph2 và Ph3 bổ sung cho nhau sẽ giúp tăng tính kháng với nhiều chủng nấm Phytophthora infestans gây bệnh hơn so với khi chỉ có một trong hai gen đơn”. Các nghiên cứu từ Trường Đại học Cornell cho thấy khi có mặt của gen kháng bệnh sương mai thứ hai ở L3708 đã tương tác lấn át đối với Ph3. Một vài chỉ thị liên kết với Ph3 được công bố gồm hai vùng trình tự đặc trưng được khuếch đại SCAR và chuỗi đa hình khuếch đại được cắt hạn chế CAPs (Zhu et al., 2006).
Phương pháp sử dụng nhiều gen, mỗi gen có vai trò nhất định liên quan đến tính kháng, nhằm tạo ra các giống cà chua kháng bệnh ổn định đã được nghiên cứu. Một số QTL kháng bệnh sương mai đã được xác định trên loài cà chua dại Lycopersicon pimpinellifolium (Fray et al., 2005). Giống L3707 thể hiện tính kháng không chuyên tính với nấm Phytophthora infestans, được quy định bởi hai gen độc lập, trội không hoàn toàn, và thể hiện tương tác trội (Jones et al., 1997). Hầu hết nguồn gen kháng bệnh của cà chua được tìm thấy ở loài hoang dại đều có thể lai với cà chua trồng. Tuy nhiên, cũng gặp một số khó khăn do sử dụng loài xa nhau về di truyền như Lycopersicon chilense hay Lycopersicon
peruvianum (Wang et al., 2016). Với phương pháp lai tạo giống truyền thống sẽ
gặp nhiều khó khăn để sử dụng các gen trong loài hoang dại. Các dạng dại thường thiếu các tính trạng cần thiết cho nhu cầu con người, năng suất thấp, chất lượng quả kém. Để hạn chế hàng loạt các gen không cần thiết đi kèm với gen cần trong quá trình lai tạo, phương pháp lai lại với dạng trồng được sử dụng.
Chọn tạo giống cà chua kháng bệnh sương mai ở Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Rau Châu Á đã được bắt đầu từ năm 1993. Giống cà chua L3708
(Lycopersicon pimpinellifolium) được chọn lọc như là giống cho tính kháng bệnh sương mai, thể hiện tính kháng cao trên đồng ruộng và trong nhà kính ở Tanzania và Đài Loan. Bên cạnh đó, CL2037 cũng đã được sàng lọc từ quá trình lai lại giữa F1 của tổ hợp lai Moneymaker × L3708 với Moneymarker. Dòng cà chua được mã hóa CL2037B mang gen Ph3 đồng hợp tử đã được chọn lọc để nhân giống và thương mại hóa (AVRDC, 1999). Những nghiên cứu này đã tạo ra một bước ngoặt lớn về nguồn vật liệu cà chua kháng bệnh sương mai cho các nghiên cứu sau này.
Với sự trợ giúp của sinh học phân tử, bản đồ liên kết gen xác định được chính xác từng gen hay QTL và vị trí của nó trên nhiễm sắc thể. Các QTL cần thiết sẽ được đưa vào cây trồng, các tính trạng không cần thiết sẽ loại bỏ nhanh chóng trong quá trình chọn lọc có sự trợ giúp của chỉ thị phân tử (Tigchelaar, 1986). Trong những năm qua, bản đồ chỉ thị phân tử đã được phát triển cho nhiều loại cây (trong đó có cà chua), thành công trong di truyền và chọn giống ứng dụng. Sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cà chua nhằm cải thiện một số tính trạng nông học như tính kháng bệnh, nâng cao năng suất và chất lượng quả.
Đối với QTL kháng bệnh sương mai của cà chua cũng được một số tác giả nghiên cứu. Brouwer et al. (2004) đã sử dụng phương pháp bản đồ cách quãng kết hợp xác định được các QTL kháng bệnh sương mai trên cả 12 nhiễm sắc thể ở cà chua, trong đó có 6 QTL ở quần thể BC- E (lb1a, lb2a, lb3, lb4, lb5b, lb11b)
và hai QTL trong quần thể BC- H (lb5ab, lb6ab). Tác giả kết luận rằng, một vài QTL kháng với Phytophthora infestans được phát hiện ở cà chua trùng với các vị trí nhiễm sắc thể của các gen kháng đã được lập bản đồ trước đó và trùng với các QTL kháng Phytophthora infestans trên khoai tây, chứng tỏ có sự bảo tồn chức năng kháng trong họ cà. Cũng trong năm 2004, nhóm tác giả đã sử dụng dòng NILs và sub- NILs để thực hiện “fine mapping” ba QTL lb4, lb5b, lb11b. Kết quả cho thấy, các QTL kháng được phát hiện trong cả ba bộ của các dòng NIL. Trong đó, lb4 định vị gần với chỉ thị TG609 và giữa hai chỉ thị TG182 và CT194 trên nhiễm sắc thể số 4 với quãng 6.9 cM; lb5b định vị với quãng 8.8 cM, giữa hai chỉ thị TG69a và TG413 trên nhiễm sắc thể số 5, rất gần với chỉ thị TG23; và
lb11 định vị với quãng 15.1 cM trên nhiễm sắc thể số 11 giữa hai chỉ thị TG194 và TG400 với đỉnh nằm giữa hai chỉ thị CT182 và TG147 (Brouwer et al., 2004).