2.2 .Nghiên cứu về thành phần hóa học
2.4.Kiểm nghiệm bằng phương pháp vi học
Kiểm nghiệm vi học là phương pháp hay dùng nhất để kiểm nghiệm dược liệu là các bộ phận của cây thuốc. Cơ sở của kiểm nghiệm vi học là dựa vào cấu tạo giải phẫu thực vật và một số phản ứng hóa thực vật.
Có hai phương pháp kiểm nghiệm vi học thường được sử dụng, đó là khảo sát vi phẫu dược liệu và khảo sát bột dược liệu.
a) Khảo sát vi phẫu dược liệu.
- Cấu tạo giải phẫu của các cơ quan thực vật là một đặc điểm quan trọng trong kiểm nghiệm dược liệu. Hình dạng và các cấu trúc của vách tế bào có ý nghĩa quan trọng nhất trong khảo sát vi học.
- Vì vậy khi quan sát các mẫu, người ta thường loại bỏ tế bào chất, nhuộm màu màng tế bào để việc quan sát được dễ dàng hơn. Tiêu bản vi phẫu thực vật được chuẩn bị qua các giai đoạn:
19
2.4.1. Chọn mẫu
Có thể dùng mẫu tươi hay khô. Nếu là mẫu khô nên ngâm mềm trước khi cắt. Mẫu được chọn phải chính xác, có tính đại diện, không quá già hoặc quá non (trừ trường hợp khảo sát cấu tạo sơ cấp phải chọn bộ phận non)
Cắt vi phẫu: Cắt bằng tay với lưỡi lam để được lát cắt thật mỏng để nhuộm. Nếu mẫu nhỏ thì cắt cả tiết diện, nếu mẫu có kích thước to thì cắt phần đại diện. Mẫu cắt là lá thường lấy đoạn 1/3 gân giữa kể từ nơi tiếp giáp với cuống và một phần phiến lá ở hai bên. Nếu là thân thì thường cắt ở lóng. Các bộ phận khác như hoa, quả, hạt,… chọn nơi cắt tùy theo yêu cầu khảo sát. Các lát cắt nên được ngâm ngay vào dung dịch thích hợp để tránh bị khô.
Phân loại: Có 2 loại phẫu thức được dùng trong kiểm nghiệm dược liệu: - Phẫu thức ngang: thông dụng nhất. Lát cắt nằm trong mặt phẳng vuông góc với trục của mẫu cắt.
- Phẫu thức dọc: thường để quan sát ống tiết hay ống nhựa mủ. Lát cắt nằm trong mặt phẳng song song với trục mẫu cắt. Lát cắt có thể đi qua trục tâm (cắt xuyên tâm) hay song song với trục tâm (cắt tiếp tuyến).
2.4.2. Nhuộm vi phẫu:
Có nhiều phương pháp và hóa chất để nhuộm tế bào thực vật, ở đây ta dùng phương pháp nhuộm kép carmin – lục iod (nhuộm kép son phèn – lục iod).
Hóa chất sử dụng: (cách pha tham khảo Dược diển Việt Nam V, phụ lục 2.1.) - Dung dịch Javel 50% dùng để loại bỏ tế bào chất.
- Dung dịch cloral hydrat 50% trong nước, dùng làm sáng tiêu bản và tẩy sạch tinh bột, nếu có.
- Dung dịch acid acetic 1% dùng để trung hòa nước Javel còn lại.
- Dung dịch KOH hay NaOH 5% tăng cường tẩy tế bào chất, dùng khi mẫu có quá nhiều tinh bột.
- Dung dịch lục iod 0,1% để nhuộm xanh màng tế bào có suberin hay lignin. - Dung dịch đỏ carmin 1% (son phèn) dùng để nhuộm hồng màng cellulose. - Nước cất.
20
2.4.3. Cách tiến hành
- Ngâm lát cắt vào dung dịch Javel 15-30 phút (cho đến khi lát cắt trở nên trắng), rửa bằng nước cất nhiều lần.
- Ngâm lát cắt vào dung dịch acid acetic 1-3% trong 2 phút để tẩy Javel còn sót lại. Rửa bằng nước cất.
- Ngâm tiếp lát cắt vào dung dịch cloral hydrat 50% (nếu thấy lát cắt chưa thật trắng và trong) khoảng 10-15 phút. Rửa bằng nước cất.
- Ngâm vào dung dịch lục iod từ 5-10 giây, Rửa bằng nước cất.
- Ngâm tiếp vào dung dịch son phèn khoảng 15-30 phút. Rửa bằng nước cất đến khi dịch rừa hết màu.
- Vi phẫu sau khi nhuộm xong có thể ngâm vào nước cất hay dung dịch glycerin 30%. Quan sát dưới kính hiển vi và vẽ hình hoặc chụp hình.
1. Ngâm lát cắt trong nước Javel 10 - 15 phút, rửa nước cất nhiều lần
2. Ngâm lát cắt vào Acid acetic 10% trong 2 phút,rửa nước cất
4. Nhuộm xanh: ngâm lục iod 5 - 10 giây, rửa nước cất
5. Nhuộm hồng: ngâm son phèn 15 - 30 phút, rửa nước cất cho đến khi hết màu. 3. Ngâm lát cắt trong dung dịch cloral hydrat 50% (nếu lát cắt còn chưa thật trắng)
khoảng 10 – 15 phút, rửa nước
21
b) Khảo sát bột dược liệu
- Mỗi dược liệu đều có những đặc điểm mô học đặc trưng, chúng được thể hiện một phần qua đặc điểm bột dược liệu. Những đặc điểm này dùng để phân biệt dược liệu này với dược liệu khác.
- Khảo sát bột dược liệu bằng kính hiển vi nhằm mục đích tìm ra những đặc điểm vi học đặc trưng của bột dược liệu giúp cho việc định danh, xác định độ tinh khiết của dược liệu, phân biệt với dược liệu dễ nhầm lẫn và phát hiện sự giả mạo nếu có.
- Cấu tạo vi phẫu và bột của cùng một bộ phận dược liệu có liên quan chặt chẽ với nhau, bổ sung cho nhau. Do đó khi soi bột nên cắt nhuộm vi phẫu trước để có thể nhận dạng các thành phần trong bột dược liệu dễ dàng và chính xác.
Chuẩn bị bột để soi: Lấy bột cần khảo sát cắt nhỏ và sấy ở nhiệt độ khoảng 600C, tán nhỏ, nghiền nát hoặc dùng máy xay. Rây qua rây số 32 (rây mịn). Phần còn lại trên rây được tán hoặc xay và rây tiếp cho đến khi tất cả dược liệu trở thành bột mịn (không được bỏ qua phần còn lại trên rây).
Chú ý : không nên sấy ở nhiệt độ quá cao có thể làm nát hoàn toàn các mô, tế bào khi xay, tán, khiến cho không thể nhận dạng cấu tử dù bằng kính hiển vi. - Trước khi soi kính hiển vi phải quan sát bột bằng cảm quan (màu sắc, mùi vị, độ
mịn, nhám, xơ…) để có thêm yếu tố kiểm nghiệm.
- Đặc điểm một số loại bột của các bộ phận dùng khác nhau như
Bột lá thường có màu xanh lục tới xanh nâu. Cấu tử thường gặp: biểu bì mang khí khổng, lông che chở, lông tiết, tinh thể calci oxalat, các mạch gỗ như mạch vạch, mạch xoắn…
o Bột vỏ thân, vỏ rễ: thường có màu vàng nâu đến nâu. Các cấu tử thường thấy là: mảnh bần, mảnh mô mềm, các loại sợi (sợi có vách dày hay mỏng, khoang rộng hay hẹp), tinh thể calci oxalat, tế bào mô cứng, mạch gỗ v.v... o Bột hoa, quả, hạt: có màu sắc thay đổi tùy theo dược liệu. Việc xác định
các cấu tử cần kết hợp, so sánh với từng bộ phận của dược liệu. Ví dụ cần xác định mảnh cánh hoa ở phần soi bột thì phải tách cánh hoa ở hoa, đem
22 soi riêng mới đi đến kết luận. Dược liệu là hoa cần chú ý đến đặc điểm của hạt phấn.
Cách lên tiêu bản bột soi: Cho một giọt nước cất vào giữa phiến kính, dùng que sạch trộn đều bột, lấy một ít bột cho vào giữa giọt chất lỏng, khuấy nhẹ để phân tán bột và đậy lá kính lại. Lấy ngón tay trỏ di nhẹ trên lá kính để các phần tử của bột tách rời nhau và phân tán đều. Loại bỏ phần bột và nước thừa nằm ngoài lá kính bằng giấy thấm, lau sạch mặt trên phiến kính và lá kính trước khi soi kính hiển vi.
3. PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC
- Trong nghiên cứu, sản xuất dược liệu và các chế phẩm từ dược liệu, để chiết xuất và tinh chế các cao chiết dược liệu, kiểm soát và bảo đảm chất lượng dược liệu và các chế phẩm từ dược liệu hay phân lập các chất tinh khiết từ dược liệu, người ta cần biết thành phần hóa học có trong dược liệu đó.
- Thành phần hóa học của một dược liệu thường rất phức tạp và không thể được biết tường tận. Vì thế, việc nghiên cứu thành phần hóa học của dược liệu thường được bắt đầu bằng việc xác định các nhóm hợp chất thường gặp trong thực vật bằng các phản ứng hóa học đặt trưng cho nhóm hợp chất đó để xác định sự có mặt của chúng trong dược liệu. Công việc này được gọi là phân tích thành phần hóa thực vật.
3.1. Xác định các nhóm hợp chất trong dịch chiết bằng các phản ứng đặc trưng
Bước 1: Chuẩn bị các dịch chiết
- Dịch chiết ether: Chiết 10-25 g bột dược liệu bằng diethyl ether trong Soxhlet hay lắc trong một bình nón 10-20 phút cho tới khi bốc hơi dịch chiết không còn cắn. Gộp lại, lọc và cô đến khi còn khoảng 50ml.
- Dịch chiết cồn: Bã dược liệu tiếp tục chiết bằng cồn cao độ (hay methanol) 20- 30 phút trên bếp cách thủy 2-3 lần. Gộp lại, lọc và cô đến khi còn khoảng 50ml dịch chiết cồn.
23 - Một phần dịch chiết được thủy phân để định tính các aglycon. Lấy 15ml dịch chiết cồn thêm 10ml acid hydrochloric 10% và đun 30 phút, cô còn 50%, thêm 20ml nước. Để nguội, lắc với ether ethylic (15ml x 3 lần) và đem định tính aglycon.
- Dịch chiết nước: Bã dược liệu tiếp tục chiết nóng với nước trên bếp cách thủy sôi. Gộp lại, lọc và cô đến khi còn khoảng 50ml. Một phần dịch chiết nước được thủy phân để định tính các aglycon. Lấy 15ml dịch chiết nước thêm 10ml acid hydrochloric 10% và đun 30 phút. Để nguội, lắc phân bố với ether ethylic (15ml x 3 lần) và dùng dịch này để đinh tính aglycon.
Bước 2: Xác định các nhóm hợp chất