Tầng lông hút Tầng suberoid Nội bì khung hình chữ U Gỗ 1 Libe 1 Mô mềm khuyết Mạch hậu mộc
36 Hình 3.13. Cấu tạo vi phẩu rễ cây Náng hoa trắng khi quan sát vật kính 10x
Hình 3.14. Vi phẫu cắt ngang của rễ cây Náng hoa trắng
Tầng lông hút Tầng suberoid Nội bì khung hình chữ U Libe 1 Gỗ 1 Mạch hậu mộc Mô mềm khuyết Mô mềm khuyết Tầng suberoid Mô mềm khuyết Nội bì khung hình chữ U Gỗ 1 Libe 1 Bó libe-gỗ xếp xen kẽ nhau trên 1 vòng, gỗ phân hóa hướng tâm Mạch hậu mộc Mô mềm tủy Tầng lông hút (Chỉ còn là vết tích với một vài tế bào móp méo không đều)
37
1.3. Bóc tách biểu bì
Lỗ khí trải dài khắp lá non (Kiểu một lá mầm)
Lỗ khí nằm thưa thớt ở lá già (Kiểu một lá mầm)
Lỗ khí ở lá non Lỗ khí ở lá già
Lỗ khí ở lá non Lỗ khí ở lá già
Hình 3.15. Sự khác biệt khi bóc tách biểu bì - lỗ khí giữa lá non và lá già qua các vật kính khác nhau.
38 Hình 3.16. Bóc tách biểu bì – lỗ khí kiểu 1 lá mầm (hình vẽ)
Lỗ khí ở lá non xếp gần nhau hơn lỗ khí ở lá già. Do trong quá trình phát triển, lá già ngày càng mọc dài và to ra nên lỗ khí nằm sẽ thưa thớt – trải dài ra hơn so với lúc còn non.
1.4. Đặc điểm bột dược liệu
Bột lá
Màu trắng xanh, không mùi, không vị.
Bột thân
Màu nâu sáng, không mùi, vị hơi đắng.
Bột rễ
Màu vàng nhạt, không mùi, không vị. Hình 3.17. Các loại bột của cây Náng hoa trắng khi quan sát bằng mắt thường Soi kính hiển vi thấy:
- Mảnh biểu bì tế bào hình chữ nhật, có nhiều lỗ khí kiểu 1 lá mầm. - Mảnh mô mềm tế bào vách mỏng và uốn lượn.
39 - Mảnh mạch xoắn.
- Cuộn sợi nhiều, thường bung ra thành những sợi xoắn rất dài.
- Tinh thể calci oxalat hình kim, hai đầu nhọn dài 100 - 110 µm, đường kính khoảng 2 µm – 3 µm, nằm rải rác hay thành tụ thành đám.
1.5. Soi bột dược liệu
1.5.1. Soi bột lá
Hình 3.18. Lỗ khí (kiểu 1 lá mầm) - soi bột lá cây Náng hoa trắng
Hình 3.19. Mạch xoắn - soi bột lá Náng hoa trắng Náng hoa trắng
Hình 3.20.Mạch vòng - soi bột lá Náng hoa trắng Náng hoa trắng
40
1.5.2. Soi bột thân
Hình 3.21. Mô mềm có chứa hạt tinh bột - soi bột thân cây NHT
Hình 3.22.Hạt tinh bột Náng hoa trắng - soi bột thân cây NHT Đám tinh bột Đám tinh bột
41 Hình 3.23. Đám tinh thể calci oxalat hình kim - soi bột thân cây NHT
1.5.3. Soi bột rễ
42 Hình 3.25. Mạch vòng và mạch xoắn - soi bột rễ cây NHT
Hình 3.26. Lông hút - soi bột rễ cây NHT
Hình 3.27. Sơ đồ soi bột dược liệu cây Náng hoa trắng
43
2. PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC
2.1. Xác định các chất tan trong dịch chiết ether
Dịch ether được dùng để xác định các nhóm hợp chất sau: 1. Tinh dầu 2. Chất béo 3. Carotenoid 4. Triterpenoid tự do 5. Alkaloid 6. Coumarin 7. Anthraquinon 8. Flavonoid 2.1.1.Xác định tinh dầu
Lấy khoảng 5ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cạn. Nếu cắn có mùi thơm nhẹ, thêm vào cắn một ít cồn cao độ (TT) rồi lại bốc hơi cho đến cắn. Cắn có mùi thơm nhẹ đặc trưng: có tinh dầu.
Hình 3.28. Xác định tinh dầu trong dịch chiết ether (-) Kết quả: không có tinh dầu trong dịch chiết ether (-)
2.1.2. Xác định chất béo
Lấy vài giọt dịch chiết ether nhỏ lên cùng một chỗ trên một miếng giấy mỏng, hơ hoặc sấy nhẹ cho bay hết dung môi (và hết mùi thơm nếu dịch chiết có tinh dầu). Nếu tại nơi nhỏ dịch chiết có vết trong mờ: có chất béo.
Hình 3.29.Xác định chất béo trong dịch chiết ether (+) Kết quả: có dầu béo trong dịch chiết ether
44 2.1.3. Định tính carotenoid
Lấy khoảng 5ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi nhẹ tới cắn (và gần như không còn mùi thơm nếu dịch chiết có tinh dầu). Thêm vào cắn vài giọt H2SO4
đậm đặc. Dung dịch có màu xanh dương đậm hay màu xanh lục ngả sang màu xanh dương: có carotenoid.
(Nếu phản ứng bị ảnh hưởng bởi chlorophyll, có thể loại chlorophyll ra khỏi dịch chiết ether bằng cách đun nóng với một lượng nhỏ than hoạt và lọc lấy dịch chiết để thực hiện phản ứng.)
Hình 3.30. Định tính carotenoid trong dịch chiết ether (+)
Kết quả: dung dịch có màu xanh dương đậm => có carotenoid trong dịch chiết ether
2.1.4. Định tính triterpenoid
Lấy khoảng 5ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa tan cắn với 0,5ml anhydrid acetic rồi thêm vào dung dịch 0,5ml chloroform. Chuyển vào dung dịch vào một ống nghiệm nhỏ, khô. Dùng pipet Pasteur thêm cẩn thận 1-2ml H2SO4 đậm đặc lên thành ống nghiệm để nghiêng cho acid chảy xuống đáy ống nghiệm. Nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp dung dịch phía trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím: có triterpenoid (phytosterol hoặc các triterpen) tự do.
Dung dịch chuyển sang màu xanh dương
45 Hình 3.31. Định tính triterpenoid trong dịch chiết ether (+)
Ống 1: ống chứng
Ống 2: ống thử - dung dịch phía trên dần chuyển thành màu xanh lục hay tím Kết quả: có triterpenoid trong dịch chiết ether
2.1.5. Định tính alkaloid
Lấy khoảng 10ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa cắn trong 2 - 4ml dung dịch acid hydroclorid 1%. Chia dung dịch acid vào 4 ống nghiệm nhỏ. Định tính alkaloid bằng các thuốc thử Mayer, Bouchardat, Bertrand ( có sử dụng thêm một vài thuốc thử tạo tủa khác như thuốc thử Dragendorff, thuốc thử Hager...).
Thuốc thử Kết quả
Thuốc thử Valse – Mayer tủa trắng – vàng nhạt. Thuốc thử Dragendorff tủa đỏ cam.
Thuốc thử Bouchardat tủa đỏ nâu. Thuốc thử Bertrand tủa trắng
Thuốc thử Hager tủa vàng cam
Bảng 3.1. Các thuốc thử định tính alkaloid
So sánh với ống chứng không có thuốc thử. Nếu dung dịch đục hoặc có tủa: có alkaloid.
46 Hình 3.32. Định tính alkaloid trong dịch chiết ether (+)
Ống 1: ống chứng.
Ống 2: Thuốc thử Valse – Mayer (có tủa vàng nhạt trong ống)
Ống 3: Thuốc thử Bouchardat (có tủa đỏ nâu trong ống) Ống 4: Thuốc thử Dragendorff (có tủa đỏ cam trong ống) Kết quả: có alkaloid trong dịch chiết ether
2.1.6. Định tính coumarin
Lấy khoảng 5ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa cắn trong 2ml cồn 70%. Chia đều dịch chiết vào 2 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào ống thứ nhất 0,5ml KOH 10% và ống thứ 2 một lượng nước cất tương đương. Đun cách thủy cả 2 ống nghiệm trong 2 phút, để nguội và soi dưới đèn tử ngoại 365nm. Dung dịch trong ống 1 có huỳnh quang mạnh hơn dung dịch trong ống thứ 2: có coumarin.
Hình 3.33. Định tính coumarin trong dịch chiết ether (+)
Ống 1: thêm 0,5ml KOH 10% Ống 2: thêm lượng nước cất tương đương.
Sau khi soi đèn:
Kết quả: ống 1 có huỳnh quang mạnh hơn dung dịch trong ống thứ 2
Có coumarin trong dịch chiết ether
47
2.1.7. Định tính anthraquinon
Lấy khoảng 5ml dịch ether cho vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào 1ml dung dịch NaOH 10% và lắc kỹ. Nếu lớp kiềm có màu hồng tới đỏ: có anthraquinon dạng tự do
Hình 3.34. Định tính anthraquinon trong dịch chiết ether (-)
Ống 1: ống chứng
Ống 2: ống thử - màu xanh lá nhạt, ở lớp trên màu xanh lá đậm
Không có màu hồng tới đỏ Không có anthraquinon dạng tự
do trong dịch chiết ether.
2.1.8. Định tính flavonoid
Lấy khoảng 10ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn khô. Hòa cắn với 2 ml cồn và gạn dịch cồn vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào dung dịch 1 ít bột magnesi kim loại và thêm từ từ 0,5ml HCl đậm đặc. Nếu sau phản ứng, dung dịch có màu hồng tới đỏ: có Flavonoid.
Hình 3.35. Định tính flavonoid trong dịch chiết ether (-)
Ống 1: ống chứng.
Ống 2: ống thử - màu xanh đậm Không có màu hồng tới đỏ Không có flavonoid trong dịch
48
2.2. Xác định các nhóm hợp chất tan trong dịch chiết cồn
1. Alkaloid 2. Coumarin 3. Glycosid tim 4. Flavonoid 5. Tannin 6. Saponin 7. Các chất khử 8. Acid hữu cơ
2.2.1. Định tính alkaloid
Hình 3.36. Định tính alkaloid trong dịch chiết cồn (+) Ống 1: ống chứng.
Ống 2: Thuốc thử Dragendorff (có tủa đỏ cam trong ống)
Ống 3: Thuốc thử Bouchardat (có tủa đỏ nâu trong ống)
Ống 4: Thuốc thử Valse – Mayer (có tủa vàng nhạt trong ống) Kết quả: có alkaloid trong dịch chiết cồn
2.2.2. Định tính coumarin
Lấy khoảng 5ml dịch cồn cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa cắn trong 2ml cồn 70%, chia đều dịch chiết vào 2 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào ống thứ nhất 0,5ml KOH 10% và ống thứ hai một lượng nước cất tương đương. Đun cách thủy hai ống nghiệm trong 2 phút, để nguội và soi dưới đèn tử ngoại 365nm.
Sự xuất hiện của huỳnh quang mạnh của ống thứ nhất chứng tỏ sự có mặt của coumarin. Thêm vào cả hai ống nghiệm, mỗi ống 2,5ml nước cất. Nếu dung dịch trong ống 1 trong hơn dung dịch ống 2: có Coumarin.
49 Hình 3.37. Định tính coumarin trong dịch chiết cồn (+)
Ống 1: thêm 0,5ml KOH 10%
Ống 2: thêm lượng nước cất tương đương. Sau khi soi đèn tử ngoại 365nm
Kết quả: ống 1 có huỳnh quang mạnh hơn dung dịch trong ống thứ 2. Có coumarin trong dịch chiết cồn
2.2.3. Định tính glycosid tim
Định tính đường 2-desoxy: Lấy 5ml dịch cồn cho vào chén sứ bốc hơi cho tới cắn. Hòa lại cắn với 5ml thuốc thử xanthydrol khuấy cho tan hết cắn, đậy ống nghiệm bằng nút bông gòn, cách thủy 5 phút. Nếu có màu hồng đến đỏ mận: có đường 2-desoxy.
Hình 3.38. Định tính glycosid tim trong dịch chiết cồn (-) Ống 1: ống chứng.
Ống 2: ống thử - không có màu hồng đến đỏ mận.
50 2.2.4. Định tính flavonoid
Lấy khoảng 5ml dịch cồn cho vào chén sứ, bốc hơi còn khoảng 2ml và gạn dịch cồn vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào dung dịch một ít bột magnesi kim loại và 0,5ml HCl đđ. Nếu dung dịch có màu từ hồng tới đỏ: Có flavonoid.
Hình 3.39. Định tính flavonoid trong dịch chiết cồn (-) Ống 1: ống chứng.
Ống 2: ống thử - không có màu từ hồng tới đỏ. Không cóflavonoid trong dịch chiết cồn
a) Định tính anthocyanosid
Lấy 1ml dịch chiết cho vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm 2-3 giọt dung dịch acid hydrocloric 10%. Nếu dung dịch có màu hồng đỏ tới đỏ và chuyển sang màu xanh khi kiềm hóa bằng dung dịch natri hydroxid 10%: Có anthocyanosid.
Hình 3.40. Định tính anthocyanosid trong dịch chiết cồn (-) Ống 1: ống chứng.
Ống 2: ống thử - không có màu từ hồng tới đỏ và chuyển sang màu xanh khi kiềm hóa bằng dung dịch natri hydroxid 10%
51 b) Định tính proanthocyanidin
Lấy 5ml dịch chiết cho vào 1 ống nghiệm. Thêm 2ml dung dịch acid hydrocloric 10% và đun trong bếp cách thủy 10 phút. Nếu dung dịch có màu hồng tới đỏ: Có proanthocyanidin
Hình 3.41. Định tính proanthocyanidin trong dịch chiết cồn (-)
Ống 1: ống chứng. Ống 2: ống thử - không có màu từ hồng tới đỏ. Không có proanthocyanidin trong dịch chiết cồn
2.2.5. Định tính tannin
Lấy 2ml dịch chiết cho vào một chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa tan cắn với 4ml nước trên bếp cách thủ. Lọc, chia dịch chiết vào hai ống nghiệm.
a. Ống nghiệm thứ nhất: pha loãng 0,5ml dịch chiết với 1ml nước cất. Thêm 2-3 giọt thuốc thử FeCl3 5%, lắc đều. Nếu dung dịch có màu xanh đen hay xanh rêu: Có polyphenol.
Hình 3.42. Định tính polyphenol trong dịch chiết cồn (-)
Ống 1: ống chứng. Ống 2: ống thử - không có màu xanh đen hay xanh rêu. Không có polyphenol trong dịch chiết cồn
52 b. Ống nghiệm thứ hai: Thêm vào dịch lọc 5 giọt dung dịch gelatin muối, lắc đều, so sánh với ống chứng chứa dịch chiết ban đầu. Nếu có tủa bông trắng:
Có tannin.
Hình 3.43. Định tính tannin trong dịch chiết cồn (-)
Ống 1: ống chứng. Ống 2: ống thử - không có tủa bông trắng. Không có tannin trong dịch chiết cồn
2.2.6. Định tính saponin
Lấy 5ml dịch chiết cồn cho vào chén sứ, cô trên bếp cách thủy tới cắn. Hòa cắn trong 5ml cồn 25% trên bếp cách thủy lọc vào ống nghiệm. Thêm 5ml nước và lắc mạnh theo chiều dọc ống. Nếu có bọt bền: có saponin
Hình 3.44. Định tính saponin trong dịch chiết cồn (+) Ống thử: có bọt bền trong ống nghiệm.
Có saponin trong dịch chiết cồn
53 2.2.7. Định tính các chất khử
Lấy 5ml dịch chiết cho vào 1 chén sứ, bốc hơi dịch cồn đến cắn. Hòa cắn với 3ml nước cất trên bếp cách thủy, để nguội và lọc qua giấy lọc. Thêm vào dịch lọc 0,5ml dung dịch Fehling A và 0,5ml dung dịch Fehling B. Đun cách thủy 5 phút. Nếu có kết tủa đỏ gạch dưới đáy ống nghiệm: Có các hợp chất khử (chủ yếu là đường khử).
Hình 3.45. Định tính các hợp chất khử trong dịch chiết cồn (+)
2.2.8. Định tính các acid hữu cơ
Lấy 2ml dịch chiết cho vào một ống nghiệm. Pha loãng với 1ml nước và thêm vào dung dịch một ít tinh thể natri carbonat. Nếu có các bọt khí nhỏ sủi lên từ các tinh thể Na2CO3: Có acid hữu cơ.
Hình 3.46. Định tính acid hữu cơ trong dịch chiết cồn (+) Ống nghiệm có các bọt khí nhỏ sủi lên từ các tinh thể Na2CO3
Có acid hữu cơ trong dịch chiết cồn
54
2.3. Xác định các chất tan trong dịch chiết nước
1. Alkaloid 2. Glycosid tim 3. Flavonoid 4. Tanin 5. Saponin 6. Các chất khử
7. Acid hữu cơ 8. Polyuronid
2.3.1. Định tính alkaloid
Lấy khoảng 10ml dịch nước cho vào một bình lắng gạn 50ml, kiểm hóa dịch chiết tới pH 10 bằng dung dịch NH4OH 10% và chiết bằng ether ethylic hoặc chloroform (10ml x 3 lần). Gộp chung và rửa lớp dung môi hữu cơ với 10ml bằng nước cất. Lắc lớp ether với dung dịch acid hydrocloric 5% (2ml x 3 lần). Chia dung dịch acid vào 4 ống nghiệm nhỏ. Định tính alkaloid bằng các thuốc thử: Mayer, Dragendorff và Bouchardat.
Ống 1: Thuốc thử Valse – Mayer: tủa trắng – vàng nhạt. Ống 2: Thuốc thử Dragendorff: tủa đỏ cam.
Ống 3: Thuốc thử Bouchardat: tủa đỏ nâu.
So sánh với ống chứng không có thuốc thử. Nếu dung dịch đục hoặc có tủa: có alkaloid.
Hình 3.47. Định tính alkaloid trong dịch chiết nước (+) Ống 1: Ống chứng
Ống 2: Thuốc thử Bouchardat (có tủa đỏ nâu trong ống)
Ống 3: Thuốc thử Valse – Mayer (có tủa vàng nhạt trong ống) Ống 4: Thuốc thử Dragendorff (có tủa đỏ cam trong ống) Có alkaloid trong dịch chiết nước
55 2.3.2. Xác định glycosid tim
a. Định tính vòng lacton 5 cạnh: Lấy 5ml dịch nước cho vào chén sứ bốc hơi cho tới cắn. Hòa lại cắn với 2ml cồn 25%, gạn dịch cồn vào 1 ống nghiệm nhỏ. Cho vào 2 – 3 giọt dung dịch 1% của m-dinitrobenzen trong cồn 96% rồi thêm vào 3 giọt KOH 5% (phản ứng Raymond – Marthoud). Nếu xuất hiện màu tím: Có các cardenolid.
Hình 3.48. Định tính vòng lacton 5 cạnh trong dịch chiết nước (-) Không có vòng lacton 5 cạnh
b. Định tính đường 2 – desoxy: Lấy 5ml dịch chiết nước bốc hơi cho tới cắn. Hòa lại cắn với 5ml thuốc thử xanthydrol khuấy cho tan hết cắn, đậy ống nghiệm bằng nút bông gòn, cách thủy trong 5 phút. Nếu có màu hồng đến đỏ mận:
Có đường 2 – desoxy.
Hình 3.49. Định tính đường 2 – desoxy trong dịch chiết nước (-) Không có đường 2 – desoxytrong dịch chiết nước
56
2.3.3. Định tính flavonoid
Lấy khoảng 5ml dịch nước cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa tan cắn trong khoảng 2ml cồn 25%, lọc vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào dung dịch một ít bột magnesi kim loại và 0,5ml HCl đđ (phản ứng cyanidin). Nếu dung dịch có màu từ hồng tới đỏ: Có flavonoid (flavanon, flavanonol, flavon, flavonol).
Hình 3.50. Định tính flavonoid trong dịch chiết nước (+)
Ống 1: ống chứng Ống 2: ống thử - có màu đỏ mận Có Flavonoid trong dịch chiết nước