So sánh với ống chứng không có thuốc thử. Nếu dung dịch đục hoặc có tủa: có alkaloid.
46 Hình 3.32. Định tính alkaloid trong dịch chiết ether (+)
Ống 1: ống chứng.
Ống 2: Thuốc thử Valse – Mayer (có tủa vàng nhạt trong ống)
Ống 3: Thuốc thử Bouchardat (có tủa đỏ nâu trong ống) Ống 4: Thuốc thử Dragendorff (có tủa đỏ cam trong ống) Kết quả: có alkaloid trong dịch chiết ether
2.1.6. Định tính coumarin
Lấy khoảng 5ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa cắn trong 2ml cồn 70%. Chia đều dịch chiết vào 2 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào ống thứ nhất 0,5ml KOH 10% và ống thứ 2 một lượng nước cất tương đương. Đun cách thủy cả 2 ống nghiệm trong 2 phút, để nguội và soi dưới đèn tử ngoại 365nm. Dung dịch trong ống 1 có huỳnh quang mạnh hơn dung dịch trong ống thứ 2: có coumarin.
Hình 3.33. Định tính coumarin trong dịch chiết ether (+)
Ống 1: thêm 0,5ml KOH 10% Ống 2: thêm lượng nước cất tương đương.
Sau khi soi đèn:
Kết quả: ống 1 có huỳnh quang mạnh hơn dung dịch trong ống thứ 2
Có coumarin trong dịch chiết ether
47
2.1.7. Định tính anthraquinon
Lấy khoảng 5ml dịch ether cho vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào 1ml dung dịch NaOH 10% và lắc kỹ. Nếu lớp kiềm có màu hồng tới đỏ: có anthraquinon dạng tự do
Hình 3.34. Định tính anthraquinon trong dịch chiết ether (-)
Ống 1: ống chứng
Ống 2: ống thử - màu xanh lá nhạt, ở lớp trên màu xanh lá đậm
Không có màu hồng tới đỏ Không có anthraquinon dạng tự
do trong dịch chiết ether.
2.1.8. Định tính flavonoid
Lấy khoảng 10ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn khô. Hòa cắn với 2 ml cồn và gạn dịch cồn vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào dung dịch 1 ít bột magnesi kim loại và thêm từ từ 0,5ml HCl đậm đặc. Nếu sau phản ứng, dung dịch có màu hồng tới đỏ: có Flavonoid.
Hình 3.35. Định tính flavonoid trong dịch chiết ether (-)
Ống 1: ống chứng.
Ống 2: ống thử - màu xanh đậm Không có màu hồng tới đỏ Không có flavonoid trong dịch
48
2.2. Xác định các nhóm hợp chất tan trong dịch chiết cồn
1. Alkaloid 2. Coumarin 3. Glycosid tim 4. Flavonoid 5. Tannin 6. Saponin 7. Các chất khử 8. Acid hữu cơ
2.2.1. Định tính alkaloid
Hình 3.36. Định tính alkaloid trong dịch chiết cồn (+) Ống 1: ống chứng.
Ống 2: Thuốc thử Dragendorff (có tủa đỏ cam trong ống)
Ống 3: Thuốc thử Bouchardat (có tủa đỏ nâu trong ống)
Ống 4: Thuốc thử Valse – Mayer (có tủa vàng nhạt trong ống) Kết quả: có alkaloid trong dịch chiết cồn
2.2.2. Định tính coumarin
Lấy khoảng 5ml dịch cồn cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa cắn trong 2ml cồn 70%, chia đều dịch chiết vào 2 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào ống thứ nhất 0,5ml KOH 10% và ống thứ hai một lượng nước cất tương đương. Đun cách thủy hai ống nghiệm trong 2 phút, để nguội và soi dưới đèn tử ngoại 365nm.
Sự xuất hiện của huỳnh quang mạnh của ống thứ nhất chứng tỏ sự có mặt của coumarin. Thêm vào cả hai ống nghiệm, mỗi ống 2,5ml nước cất. Nếu dung dịch trong ống 1 trong hơn dung dịch ống 2: có Coumarin.
49 Hình 3.37. Định tính coumarin trong dịch chiết cồn (+)
Ống 1: thêm 0,5ml KOH 10%
Ống 2: thêm lượng nước cất tương đương. Sau khi soi đèn tử ngoại 365nm
Kết quả: ống 1 có huỳnh quang mạnh hơn dung dịch trong ống thứ 2. Có coumarin trong dịch chiết cồn
2.2.3. Định tính glycosid tim
Định tính đường 2-desoxy: Lấy 5ml dịch cồn cho vào chén sứ bốc hơi cho tới cắn. Hòa lại cắn với 5ml thuốc thử xanthydrol khuấy cho tan hết cắn, đậy ống nghiệm bằng nút bông gòn, cách thủy 5 phút. Nếu có màu hồng đến đỏ mận: có đường 2-desoxy.
Hình 3.38. Định tính glycosid tim trong dịch chiết cồn (-) Ống 1: ống chứng.
Ống 2: ống thử - không có màu hồng đến đỏ mận.
50 2.2.4. Định tính flavonoid
Lấy khoảng 5ml dịch cồn cho vào chén sứ, bốc hơi còn khoảng 2ml và gạn dịch cồn vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào dung dịch một ít bột magnesi kim loại và 0,5ml HCl đđ. Nếu dung dịch có màu từ hồng tới đỏ: Có flavonoid.
Hình 3.39. Định tính flavonoid trong dịch chiết cồn (-) Ống 1: ống chứng.
Ống 2: ống thử - không có màu từ hồng tới đỏ. Không cóflavonoid trong dịch chiết cồn
a) Định tính anthocyanosid
Lấy 1ml dịch chiết cho vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm 2-3 giọt dung dịch acid hydrocloric 10%. Nếu dung dịch có màu hồng đỏ tới đỏ và chuyển sang màu xanh khi kiềm hóa bằng dung dịch natri hydroxid 10%: Có anthocyanosid.
Hình 3.40. Định tính anthocyanosid trong dịch chiết cồn (-) Ống 1: ống chứng.
Ống 2: ống thử - không có màu từ hồng tới đỏ và chuyển sang màu xanh khi kiềm hóa bằng dung dịch natri hydroxid 10%
51 b) Định tính proanthocyanidin
Lấy 5ml dịch chiết cho vào 1 ống nghiệm. Thêm 2ml dung dịch acid hydrocloric 10% và đun trong bếp cách thủy 10 phút. Nếu dung dịch có màu hồng tới đỏ: Có proanthocyanidin
Hình 3.41. Định tính proanthocyanidin trong dịch chiết cồn (-)
Ống 1: ống chứng. Ống 2: ống thử - không có màu từ hồng tới đỏ. Không có proanthocyanidin trong dịch chiết cồn
2.2.5. Định tính tannin
Lấy 2ml dịch chiết cho vào một chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa tan cắn với 4ml nước trên bếp cách thủ. Lọc, chia dịch chiết vào hai ống nghiệm.
a. Ống nghiệm thứ nhất: pha loãng 0,5ml dịch chiết với 1ml nước cất. Thêm 2-3 giọt thuốc thử FeCl3 5%, lắc đều. Nếu dung dịch có màu xanh đen hay xanh rêu: Có polyphenol.
Hình 3.42. Định tính polyphenol trong dịch chiết cồn (-)
Ống 1: ống chứng. Ống 2: ống thử - không có màu xanh đen hay xanh rêu. Không có polyphenol trong dịch chiết cồn
52 b. Ống nghiệm thứ hai: Thêm vào dịch lọc 5 giọt dung dịch gelatin muối, lắc đều, so sánh với ống chứng chứa dịch chiết ban đầu. Nếu có tủa bông trắng:
Có tannin.
Hình 3.43. Định tính tannin trong dịch chiết cồn (-)
Ống 1: ống chứng. Ống 2: ống thử - không có tủa bông trắng. Không có tannin trong dịch chiết cồn
2.2.6. Định tính saponin
Lấy 5ml dịch chiết cồn cho vào chén sứ, cô trên bếp cách thủy tới cắn. Hòa cắn trong 5ml cồn 25% trên bếp cách thủy lọc vào ống nghiệm. Thêm 5ml nước và lắc mạnh theo chiều dọc ống. Nếu có bọt bền: có saponin
Hình 3.44. Định tính saponin trong dịch chiết cồn (+) Ống thử: có bọt bền trong ống nghiệm.
Có saponin trong dịch chiết cồn
53 2.2.7. Định tính các chất khử
Lấy 5ml dịch chiết cho vào 1 chén sứ, bốc hơi dịch cồn đến cắn. Hòa cắn với 3ml nước cất trên bếp cách thủy, để nguội và lọc qua giấy lọc. Thêm vào dịch lọc 0,5ml dung dịch Fehling A và 0,5ml dung dịch Fehling B. Đun cách thủy 5 phút. Nếu có kết tủa đỏ gạch dưới đáy ống nghiệm: Có các hợp chất khử (chủ yếu là đường khử).
Hình 3.45. Định tính các hợp chất khử trong dịch chiết cồn (+)
2.2.8. Định tính các acid hữu cơ
Lấy 2ml dịch chiết cho vào một ống nghiệm. Pha loãng với 1ml nước và thêm vào dung dịch một ít tinh thể natri carbonat. Nếu có các bọt khí nhỏ sủi lên từ các tinh thể Na2CO3: Có acid hữu cơ.
Hình 3.46. Định tính acid hữu cơ trong dịch chiết cồn (+) Ống nghiệm có các bọt khí nhỏ sủi lên từ các tinh thể Na2CO3
Có acid hữu cơ trong dịch chiết cồn
54
2.3. Xác định các chất tan trong dịch chiết nước
1. Alkaloid 2. Glycosid tim 3. Flavonoid 4. Tanin 5. Saponin 6. Các chất khử
7. Acid hữu cơ 8. Polyuronid
2.3.1. Định tính alkaloid
Lấy khoảng 10ml dịch nước cho vào một bình lắng gạn 50ml, kiểm hóa dịch chiết tới pH 10 bằng dung dịch NH4OH 10% và chiết bằng ether ethylic hoặc chloroform (10ml x 3 lần). Gộp chung và rửa lớp dung môi hữu cơ với 10ml bằng nước cất. Lắc lớp ether với dung dịch acid hydrocloric 5% (2ml x 3 lần). Chia dung dịch acid vào 4 ống nghiệm nhỏ. Định tính alkaloid bằng các thuốc thử: Mayer, Dragendorff và Bouchardat.
Ống 1: Thuốc thử Valse – Mayer: tủa trắng – vàng nhạt. Ống 2: Thuốc thử Dragendorff: tủa đỏ cam.
Ống 3: Thuốc thử Bouchardat: tủa đỏ nâu.
So sánh với ống chứng không có thuốc thử. Nếu dung dịch đục hoặc có tủa: có alkaloid.
Hình 3.47. Định tính alkaloid trong dịch chiết nước (+) Ống 1: Ống chứng
Ống 2: Thuốc thử Bouchardat (có tủa đỏ nâu trong ống)
Ống 3: Thuốc thử Valse – Mayer (có tủa vàng nhạt trong ống) Ống 4: Thuốc thử Dragendorff (có tủa đỏ cam trong ống) Có alkaloid trong dịch chiết nước
55 2.3.2. Xác định glycosid tim
a. Định tính vòng lacton 5 cạnh: Lấy 5ml dịch nước cho vào chén sứ bốc hơi cho tới cắn. Hòa lại cắn với 2ml cồn 25%, gạn dịch cồn vào 1 ống nghiệm nhỏ. Cho vào 2 – 3 giọt dung dịch 1% của m-dinitrobenzen trong cồn 96% rồi thêm vào 3 giọt KOH 5% (phản ứng Raymond – Marthoud). Nếu xuất hiện màu tím: Có các cardenolid.
Hình 3.48. Định tính vòng lacton 5 cạnh trong dịch chiết nước (-) Không có vòng lacton 5 cạnh
b. Định tính đường 2 – desoxy: Lấy 5ml dịch chiết nước bốc hơi cho tới cắn. Hòa lại cắn với 5ml thuốc thử xanthydrol khuấy cho tan hết cắn, đậy ống nghiệm bằng nút bông gòn, cách thủy trong 5 phút. Nếu có màu hồng đến đỏ mận:
Có đường 2 – desoxy.
Hình 3.49. Định tính đường 2 – desoxy trong dịch chiết nước (-) Không có đường 2 – desoxytrong dịch chiết nước
56
2.3.3. Định tính flavonoid
Lấy khoảng 5ml dịch nước cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa tan cắn trong khoảng 2ml cồn 25%, lọc vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào dung dịch một ít bột magnesi kim loại và 0,5ml HCl đđ (phản ứng cyanidin). Nếu dung dịch có màu từ hồng tới đỏ: Có flavonoid (flavanon, flavanonol, flavon, flavonol).
Hình 3.50. Định tính flavonoid trong dịch chiết nước (+)
Ống 1: ống chứng Ống 2: ống thử - có màu đỏ mận Có Flavonoid trong dịch chiết nước
a. Định tính anthocyanosid
Lấy 1ml dịch chiết nước cho vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm 2 – 3 giọt dung dịch acid hydrocloric 10%. Nếu dung dịch có màu hồng đỏ tới đỏ và chuyển sang màu xanh khi kiềm hóa bằng dung dịch natri hydroxid 10%: Có anthocyanosid.
Hình 3.51. Định tính anthocyanosid trong dịch chiết nước (-)
Ống 1: ống chứng Ống 2: ống thử (màu xanh)=> nhưng không có từ màu hồng đỏ tới đỏ và chuyển sang màu xanh khi kiềm hóa. Không có anthocyanosidtrong dịch chiết nước
57 b. Định tính proanthocyanidin
Lấy 5ml dịch chiết nước vào ống nghiệm. Thêm 2ml dung dịch acid hydrocloric 10% và đun trong bếp cách thủy 10 phút. Nếu dung dịch có màu hồng đỏ tới đỏ: Có proanthocyanidin.
Hình 3.52. Định tính proanthocyanidin trong dịch chiết nước (-) Dung dịch có màu xanh - không có màu hồng đỏ tới đỏ
Không có proanthocyanidin
2.3.4. Định tính tannin
a. Lấy 0,5ml dịch chiết cho vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm 2 – 3 giọt thuốc thử FeCl3 5%, lắc đều. Nếu dung dịch có màu xanh đen hay xanh rêu: Có polyphenol.
b. Lấy 2ml dịch chiết, thêm vào 5 giọt dung dịch gelatin - muối, lắc đều, so sánh với dung dịch ban đầu. Nếu có tủa bông trắng: Có tanin.
Hình 3.53. Định tính tanin trong dịch chiết nước (-) và “có polyphenol” (+) Ống 1: phản ứng a – ống có màu xanh
rêu => có polyphenol.
Ống 2: phản ứng b - ống không có tủa bông trắng => không có tanin.
58 2.3.5. Định tính saponin
Lấy khoảng 5ml dịch nước cho vào một chén sứ, đun cách thủy tới cắn khô. Hòa cắn với 5ml cồn 25%, lọc vào ống nghiệm. Pha loãng với 5ml nước, lắc mạnh theo chiều dọc của ống trong 15 giây. Nếu có cột bọt bền trong 15 phút: Có saponin.
Hình 3.54. Định tính saponin trong dịch chiết nước (+)
Ống 1: ống dịch chiết nước Ống 2: ống thử sau khi lắc có bọt bền trong 15 phút
Có saponin trong dịch chiết nước
2.3.6 Định tính hợp chất khử
Lấy 5ml dịch chiết cô cách thủy tới khô, hòa tan cắn trong cồn 25%, lọc. Cho dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 0,5ml dung dịch Fehling A và 0,5ml dung dịch Fehling B. Đun cách thủy 5 phút. Nếu có kết tủa đỏ gạch nặng lắng dưới đáy ống nghiệm: Có các chất khử (chủ yếu là đường khử).
Hình 3.55. Định tính hợp chất khử trong dịch chiết nước (+) kết tủa đỏ gạch dưới đáy ống nghiệm
59 2.3.7. Định tính các acid hữu cơ
Lấy 2ml dịch chiết cho vào một ống nghiệm. Thêm vào dung dịch một ít tinh thể natri carbonat. Nếu có các bọt khí nhỏ sủi lên từ các tinh thể Na2CO3: Có acid hữu cơ.
Hình 3.56. Định tính các acid hữu cơ trong dịch chiết nước (+) Ống 1: ống dịch chiết nước
Ống 2: ống thử - có bọt khí sủi lên từ các tinh thể Na2CO3 trong ống nghiệm => Có acid hữu cơ trong dịch chiết nước.
2.3.8. Định tính hợp chất polyuronid
Nhỏ từng giọt 2ml dịch chiết nước vào một ống nghiệm có chứa 10ml cồn 95% (hoặc aceton). Nếu có nhiều tủa bông được tạo thành: Có các polyuronid (gôm, pectin,chất nhầy...).
Hình 3.57. Định tính hợp chất polyuronid trong dịch chiết nước (+) A: ống chứng B: ống thử - có nhiều tủa bông được tạo thành
60
3. TÓM TẮT KẾT QUẢ PHÂN TÍCH
Nhóm hợp chất Thuốc thử
Cách thực hiện Phản ứng dương tính
Kết quả định tính trên các dịch chiết Kết quả
định tính chung Dịch chiết
ether
Dịch chiết cồn Dịch chiết nước Không thủy phân Không thủy phân
Chất béo Nhỏ dd lên giấy Vết trong mờ + Có
Carotenoid Carr-Price Xanh→ đỏ
H2SO4 Xanh dương hay lục→ xanh dương + Có
Tinh dầu Bốc hơi tới cắn Có mùi thơm - Không
Triterpenoid tự do Liebermann-Burchard Đỏ nâu-tím, lớp trên có màu xanh lục + Có
Alkaloid T/thử chung alkaloid Kết tủa + + + Có
Coumarin Phát quang trong kiềm Phát quang mạnh hơn + + - Có
Anthraquinon NaOH 10% Dd kiềm có màu hồng tới đỏ - - - Không
Flavonoid Mg/HCl đđ Dd có màu hồng tới đỏ - - + Không
Glycosid tím Thuốc thử vòng lacton Tím - - Không
T/thử đường 2-desoxy Đỏ mận - - Không
Anthocyanosid HCl Đỏ - - Không
KOH Xanh - - Không
Proanthocyanidin HCl/to Đỏ - - Không
Tannin Dd FeCl3 Xanh rêu hay xanh đen polyphenol - + Không
Dd gelatin muối Tủa bông trắng (tanin) - - Không
Triterpenoid thủy phân Liebermann-Burchard Đỏ nâu-tím, lớp trên có màu xanh lục
Saponin Tt Liebermann Lắc mạnh dd nước Có vòng tím nâu Tạo bọt bền trong 15 phút + + Có
Acid hữu cơ Na2CO3 Sủi bọt + + Có
Chất khử T/thử Fehling Tủa đỏ gạch + + Có
Hợp chất polyuronic Pha loãng với cồn 90% Tủa bông trắng – vàng nâu + Có
Có thể đánh giá theo các mức sau: (-): Không có; (±): Nghi ngờ; (+): Có ít; (++): Có; (+++): Có nhiều; (++++): Có rất nhiều Không có mặt của nhóm hợp chất trong dịch chiết Có thể có phản ứng nhưng không thực hiện
61
4. PHÂN TÍCH BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG (TLC)
Nhóm hoạt chất định hướng cho sắc ký lớp mỏng: Cồn tuyệt đối 99,5%
Sắc ký lớp mỏng bằng cồn tuyệt đối 99,5% để chiết xuất saponin làm dịch chiết chấm sắc ký.
- Mẫu thử: Chiết 5 – 10g dược liệu trong bình nón, thêm 15ml dung dịch cồn tuyệt đối 99,5%, đun trên bếp cách thủy ở nhiệt độ từ 50˚ – 60˚ trong 20 phút. Thu được dịch chiết cồn tuyệt đối 99,5% - cho khoảng 5 ml dịch chiết vào chén sứ sau đó đem đi cô cạn tới cắn khô. Đem cắn hòa với Methanol để chấm sắc ký - Pha tĩnh: Bảng mỏng Merck Silica Gel 60 F254 - 2,0 x 10 cm, dày 0,25 mm, không hoạt chất, kẻ một đường cách mép dưới 1 cm và trên 1 cm. Đánh dấu vạch cần chấm.
- Pha động: Hệ Clorofom - Methanol (9:1).
▪ Chuẩn bị bình sắc ký sạch và khô. Lót một miếng giấy lọc vào trong bình, chừa khoảng trống dọc theo bình để dễ quan sát được bản mỏng bên trong.
▪ Pha hệ Clorofom - Methanol (9:1) cho vào bình sắc ký ở trên, đậy kín bình và đặt bình ở nơi bằng phẳng và yên tĩnh để dung môi được