Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật sắc ký dùng để phân tích thành phần của một mẫu thử ở dạng dung dịch. Trong đó:
- Mẫu thử được chấm lên một lớp mỏng bằng kim loại hay kính được tráng một lớp mỏng chất hấp phụ (silica gel, nhôm oxyd…) đóng vai trò pha tĩnh.
- Một dung môi (hoặc hệ dung môi) khai triển di chuyển dọc bản mỏng do lực mao dẫn sẽ di chuyển các cấu tử của mẫu theo các vận tốc khác nhau.
Kết quả cuối cùng, các cấu tử trong mẫu thử sẽ được tách rời nhau ra, phân bố trên bản mỏng tạo thành các vết (gọi là sắc ký đồ) với một giá trị đặc trưng về vị trí (Rf) khác nhau:
Rf = Quãng đường vết di chuyển
Quãng đường pha động di chyển
Hợp chất Thuốc thử Hợp chất Thuốc thử
Alkaloid Dragendorff Irioid Trim – Hill
Anthraquinon KOH/MeOH Polyphenol NaOH/MeOH, FeCl3
Coumarin Diazo hóa Saponin VS, AS, hỗn dịch máu
Steroid Liebermann-Burchard Terpenoid VS, AS ( không đặc hiệu )
Hữu cơ nói chung
H2SO4 20% (không đặc hiệu)
Không no Hơi Iod (không đặc hiệu)
28
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT
1.1. Đặc điểm hình thái
Thân: cây thảo cao khoảng 1m. Thân hành(củ) mọc đơn độc, to hình cầu hoặc hình trứng thuôn, đường kính đến 10cm, thắt lại ở thành đầu. Bên ngoài được bao bọc bởi các lớp vỏ màu nâu nhạt, bên trong là lớp vỏ mọng nước. Cả 2 lớp vỏ này gắn với nhau tạo thành hình đế trụ (giả thân).
Hình 3.1. Thân NHT nhóm làm thực hành
Lá: Lá đơn, mọc cách, tập trung ở gốc thành hình hoa thị. Phiến lá chất dai, hình dải dạng bản, phẳng, dày, nạc, đầu thuôn nhọn, gốc nở rộng thành bẹ, dài tới hơn 1m, rộng 5- 10cm, màu xanh lục, nhẵn ở cả hai mặt, mép lá nguyên, lượn sóng; gân giữa lồi ở mặt dưới, mặt trên hơi lõm xuống thành hình lòng máng, các gân bên song song.Cây không có cuống lá do lá mọc thẳng từ thân hành. => Mặt lá trên sậm màu hơn mặt dưới.
Hình 3.2. Lá NHT (Mặt trên lá)
Mặt dưới lá
29 Cụm hoa: hình tán nằm ở đầu một
cán dẹp dài 40 – 60cm, to bằng ngón tay, mang 6 – 12 hoa, có khi nhiều hơn, màu trắng, bao bởi những mo dài 8 – 10 cm, có mùi thơm.
Hoa: có ống mảnh màu lục, các phiến hoa giống nhau, hẹp, dài, 6 nhị có chỉ nhị màu tím đỏ, phần dưới màu trắng, nhẵn. bao phấn màu vàng nâu.
Hình 3.3. Cụm hoa và hoa của NHT
1.2. Đặc điểm vi phẩu
Lá: vi phẫu cắt ngang có phần gân giữa lõm ở mặt trên, lồi tròn ở mặt dưới và thuôn dài ra phiến lá. Cấu tạo của gân giữa và phiến lá giống nhau.
- Biểu bì: tế bào gần như hình vuông, vách cellulose; lớp cutin mỏng; lỗ khí nhiều trên cả hai lớp biểu bì.
- Mô mềm: nhiều lớp tế bào hình tròn hay đa giác, sắp xếp lộn xộn và chừa những đạo hay khuyết nhỏ.
- Bó libe gỗ: kích thước không đều, dạng vệt dài và hẹp, xếp trên một hàng hình cung ở giữa, gồm gỗ ở trên, libe ở dưới; gỗ gồm 1-5 mạch, không đều, mạch nhỏ ở trên, mạch to ở dưới,
- Mô mềm quanh các mạch gỗ: tế bào hình đa giác, không đều, xếp khít nhau; libe dạng vệt dài, tế bào hình đa giác, không đều, vách méo mó, sắp xếp lộn xộn.
- Trên gỗ và dưới libe: thường có những cụm tế bào vách dày bằng cellulose hay tẩm chất gỗ. Cuộn sợi rải rác trong mô mềm. Tinh thể calci oxalat hình kim từng bó trong tế bào hay rải rác trong vùng mô mềm.
Rễ: vi phẫu cắt ngang hình tròn chia làm 2 vùng rõ rệt, vùng vỏ chiếm 4/5 diện tích vi phẫu, vùng trung trụ 1/5.
30 - Vùng vỏ: Tầng lông hút chỉ còn là vết tích với một vài tế bào móp méo không đều có vách tẩm chất bần. Tầng suberoid 4-6 lớp tế bào hình đa giác, vách mỏng, xếp lộn xộn và khít nhau.
- Mô mềm vỏ: tế bào vách cellulose, hình tròn hay bầu dục, sắp xếp lộn xộn chừa những khuyết nhỏ hay đạo ở góc giữa các tế bào. Nội bì khung hình chữ U với 1 lớp tế bào hình đa giác.
- Vùng trung trụ: Trụ bì 1 lớp tế bào hình đa giác, vách cellulose, xếp xen kẽ với tế bào nội bì. Libe và gỗ ngay sát dưới lớp trụ bì, gồm 12 -16 bó libe và 15-21 bó tiền mộc xếp xen kẽ nhau trên một vòng.
- Bó libe: từng cụm nhỏ hình bầu dục, tế bào hình đa giác, không đều, phân hoá hướng tâm. Bó tiền mộc hình tam giác đỉnh tiếp xúc trụ bì, gồm 3-6 mạch hình đa giác, không đều, phân hoá hướng tâm.
- Mạch hậu mộc: to, gồm 17-27 mạch kích thước không đều, có thể tiếp xúc bên dưới bó tiền mộc hay không; có thể có 1-2 mạch nằm riêng lẻ ở tâm vi phẫu.
- Tia tủy: vùng mô mềm giữa bó libe và bó gỗ, gồm 2-3 dãy tế bào hình đa giác, xếp khít nhau. Mô mềm tủy tế bào hình gần tròn, vách cellulose, xếp chừa những đạo nhỏ.
Thân hành (tham khảo): vi phẫu cắt ngang vảy hành có hình lòng máng, dày ở vùng giữa, mỏng dần về phía hai bên.
- Bó libe gỗ xếp thành một hàng hình cung, không đều, dạng vệt dài vuông góc với biểu bì, gồm gỗ ở trên và libe ở dưới; gỗ gồm 3-5 mạch nhỏ không đều, mạch nhỏ ở trên, mạch to ở dưới, mô mềm quanh mạch gỗ tế bào hình đa giác, xếp khít nhau.
- Libe dạng vệt dài, tế bào hình đa giác, không đều, vách méo mó, sắp xếp lộn xộn. Tinh thể calci oxalat hình kim từng bó trong tế bào hay rải rác trong vùng mô mềm.
31
1.2.1. Đặc điểm vi phẩu lá cây Náng hoa trắng
Hình 3.5. Sơ đồ cấu tạo lá cây Náng hoa trắng
Biểu bì trên
Mô mềm đạo hình đa giác
Gỗ 1 Libe 1 Mô dày góc Biểu bì dưới Lỗ khí
32 Bó libe gỗ xếp chồng lên nhau
Hình 3.6. Mô dày góc, bó libe – gỗ ở lá khi quan sát vật kính 40x Mô mềm đạo Mô dày góc Libe 1 Gỗ 1 Lỗ khí trải dài khắp phiến lá ở cả biểu bì trên và biểu bì dưới Biểu bì trên Biểu bì dưới Mô mềm đạo Mô dày góc Libe 1 Gỗ 1
33
1.2.2. Đặc điểm vi phẫu thân cây Náng hoa trắng (tham khảo)
Bó libe - gỗ 1, hình vòng,hai phía đối diện Bó libe - gỗ cấp 1 hình cung Hình 3.9. Một số hình cấu tạo vi phẩu ở thân cây Náng hoa trắng (tham khảo)
Biểu bì trên Lỗ khí Biểu bì dưới Libe 1 Gỗ 1 Mô mềm đạo
Hình 3.7. Cấu tạo vi phẫu phiến lá cây Náng hoa trắng
Lỗ khí
Hình 3.8. Lỗ khí và tinh thể calci oxalat hình kim nằm trải rác trong mô mềm ở lá NHT quan sát vật kính 40x
34 Bó libe gỗ cấp 1 hình
vòng, hai phía đối nhau.
Bó libe gỗ cấp 1 hình móng ngựa
Mạch xoắn
Đám tinh thể calci oxalat hình kim nằm trải rác trong mô mềm ở thân
Hình 3.10. Cấu tạo vi phẫu thân cây Náng hoa trắng (tham khảo). Libe 1 Gỗ 1 Mạch xoắn Mô mềm đạo Biểu bì Cụm libe – gỗ (nhìn chưa rõ cấu tạo)
35
1.2.3. Đặc điểm vi phẩu rễ cây Náng hoa trắng
Hình 3.11. Cấu tạo vi phẫu rễ cây Náng hoa trắng
Hình 3.12. Sơ đồ cấu tạo rễ cây Náng hoa trắng.
Tầng lông hút Tầng suberoid Nội bì khung hình chữ U Gỗ 1 Libe 1 Mô mềm khuyết Mạch hậu mộc
36 Hình 3.13. Cấu tạo vi phẩu rễ cây Náng hoa trắng khi quan sát vật kính 10x
Hình 3.14. Vi phẫu cắt ngang của rễ cây Náng hoa trắng
Tầng lông hút Tầng suberoid Nội bì khung hình chữ U Libe 1 Gỗ 1 Mạch hậu mộc Mô mềm khuyết Mô mềm khuyết Tầng suberoid Mô mềm khuyết Nội bì khung hình chữ U Gỗ 1 Libe 1 Bó libe-gỗ xếp xen kẽ nhau trên 1 vòng, gỗ phân hóa hướng tâm Mạch hậu mộc Mô mềm tủy Tầng lông hút (Chỉ còn là vết tích với một vài tế bào móp méo không đều)
37
1.3. Bóc tách biểu bì
Lỗ khí trải dài khắp lá non (Kiểu một lá mầm)
Lỗ khí nằm thưa thớt ở lá già (Kiểu một lá mầm)
Lỗ khí ở lá non Lỗ khí ở lá già
Lỗ khí ở lá non Lỗ khí ở lá già
Hình 3.15. Sự khác biệt khi bóc tách biểu bì - lỗ khí giữa lá non và lá già qua các vật kính khác nhau.
38 Hình 3.16. Bóc tách biểu bì – lỗ khí kiểu 1 lá mầm (hình vẽ)
Lỗ khí ở lá non xếp gần nhau hơn lỗ khí ở lá già. Do trong quá trình phát triển, lá già ngày càng mọc dài và to ra nên lỗ khí nằm sẽ thưa thớt – trải dài ra hơn so với lúc còn non.
1.4. Đặc điểm bột dược liệu
Bột lá
Màu trắng xanh, không mùi, không vị.
Bột thân
Màu nâu sáng, không mùi, vị hơi đắng.
Bột rễ
Màu vàng nhạt, không mùi, không vị. Hình 3.17. Các loại bột của cây Náng hoa trắng khi quan sát bằng mắt thường Soi kính hiển vi thấy:
- Mảnh biểu bì tế bào hình chữ nhật, có nhiều lỗ khí kiểu 1 lá mầm. - Mảnh mô mềm tế bào vách mỏng và uốn lượn.
39 - Mảnh mạch xoắn.
- Cuộn sợi nhiều, thường bung ra thành những sợi xoắn rất dài.
- Tinh thể calci oxalat hình kim, hai đầu nhọn dài 100 - 110 µm, đường kính khoảng 2 µm – 3 µm, nằm rải rác hay thành tụ thành đám.
1.5. Soi bột dược liệu
1.5.1. Soi bột lá
Hình 3.18. Lỗ khí (kiểu 1 lá mầm) - soi bột lá cây Náng hoa trắng
Hình 3.19. Mạch xoắn - soi bột lá Náng hoa trắng
Hình 3.20.Mạch vòng - soi bột lá Náng hoa trắng
40
1.5.2. Soi bột thân
Hình 3.21. Mô mềm có chứa hạt tinh bột - soi bột thân cây NHT
Hình 3.22.Hạt tinh bột Náng hoa trắng - soi bột thân cây NHT Đám tinh bột
41 Hình 3.23. Đám tinh thể calci oxalat hình kim - soi bột thân cây NHT
1.5.3. Soi bột rễ
42 Hình 3.25. Mạch vòng và mạch xoắn - soi bột rễ cây NHT
Hình 3.26. Lông hút - soi bột rễ cây NHT
Hình 3.27. Sơ đồ soi bột dược liệu cây Náng hoa trắng
43
2. PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC
2.1. Xác định các chất tan trong dịch chiết ether
Dịch ether được dùng để xác định các nhóm hợp chất sau: 1. Tinh dầu 2. Chất béo 3. Carotenoid 4. Triterpenoid tự do 5. Alkaloid 6. Coumarin 7. Anthraquinon 8. Flavonoid 2.1.1.Xác định tinh dầu
Lấy khoảng 5ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cạn. Nếu cắn có mùi thơm nhẹ, thêm vào cắn một ít cồn cao độ (TT) rồi lại bốc hơi cho đến cắn. Cắn có mùi thơm nhẹ đặc trưng: có tinh dầu.
Hình 3.28. Xác định tinh dầu trong dịch chiết ether (-) Kết quả: không có tinh dầu trong dịch chiết ether (-)
2.1.2. Xác định chất béo
Lấy vài giọt dịch chiết ether nhỏ lên cùng một chỗ trên một miếng giấy mỏng, hơ hoặc sấy nhẹ cho bay hết dung môi (và hết mùi thơm nếu dịch chiết có tinh dầu). Nếu tại nơi nhỏ dịch chiết có vết trong mờ: có chất béo.
Hình 3.29.Xác định chất béo trong dịch chiết ether (+) Kết quả: có dầu béo trong dịch chiết ether
44 2.1.3. Định tính carotenoid
Lấy khoảng 5ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi nhẹ tới cắn (và gần như không còn mùi thơm nếu dịch chiết có tinh dầu). Thêm vào cắn vài giọt H2SO4
đậm đặc. Dung dịch có màu xanh dương đậm hay màu xanh lục ngả sang màu xanh dương: có carotenoid.
(Nếu phản ứng bị ảnh hưởng bởi chlorophyll, có thể loại chlorophyll ra khỏi dịch chiết ether bằng cách đun nóng với một lượng nhỏ than hoạt và lọc lấy dịch chiết để thực hiện phản ứng.)
Hình 3.30. Định tính carotenoid trong dịch chiết ether (+)
Kết quả: dung dịch có màu xanh dương đậm => có carotenoid trong dịch chiết ether
2.1.4. Định tính triterpenoid
Lấy khoảng 5ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa tan cắn với 0,5ml anhydrid acetic rồi thêm vào dung dịch 0,5ml chloroform. Chuyển vào dung dịch vào một ống nghiệm nhỏ, khô. Dùng pipet Pasteur thêm cẩn thận 1-2ml H2SO4 đậm đặc lên thành ống nghiệm để nghiêng cho acid chảy xuống đáy ống nghiệm. Nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp dung dịch phía trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím: có triterpenoid (phytosterol hoặc các triterpen) tự do.
Dung dịch chuyển sang màu xanh dương
45 Hình 3.31. Định tính triterpenoid trong dịch chiết ether (+)
Ống 1: ống chứng
Ống 2: ống thử - dung dịch phía trên dần chuyển thành màu xanh lục hay tím Kết quả: có triterpenoid trong dịch chiết ether
2.1.5. Định tính alkaloid
Lấy khoảng 10ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa cắn trong 2 - 4ml dung dịch acid hydroclorid 1%. Chia dung dịch acid vào 4 ống nghiệm nhỏ. Định tính alkaloid bằng các thuốc thử Mayer, Bouchardat, Bertrand ( có sử dụng thêm một vài thuốc thử tạo tủa khác như thuốc thử Dragendorff, thuốc thử Hager...).
Thuốc thử Kết quả
Thuốc thử Valse – Mayer tủa trắng – vàng nhạt. Thuốc thử Dragendorff tủa đỏ cam.
Thuốc thử Bouchardat tủa đỏ nâu. Thuốc thử Bertrand tủa trắng
Thuốc thử Hager tủa vàng cam
Bảng 3.1. Các thuốc thử định tính alkaloid
So sánh với ống chứng không có thuốc thử. Nếu dung dịch đục hoặc có tủa: có alkaloid.
46 Hình 3.32. Định tính alkaloid trong dịch chiết ether (+)
Ống 1: ống chứng.
Ống 2: Thuốc thử Valse – Mayer (có tủa vàng nhạt trong ống)
Ống 3: Thuốc thử Bouchardat (có tủa đỏ nâu trong ống) Ống 4: Thuốc thử Dragendorff (có tủa đỏ cam trong ống) Kết quả: có alkaloid trong dịch chiết ether
2.1.6. Định tính coumarin
Lấy khoảng 5ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa cắn trong 2ml cồn 70%. Chia đều dịch chiết vào 2 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào ống thứ nhất 0,5ml KOH 10% và ống thứ 2 một lượng nước cất tương đương. Đun cách thủy cả 2 ống nghiệm trong 2 phút, để nguội và soi dưới đèn tử ngoại 365nm. Dung dịch trong ống 1 có huỳnh quang mạnh hơn dung dịch trong ống thứ 2: có coumarin.
Hình 3.33. Định tính coumarin trong dịch chiết ether (+)
Ống 1: thêm 0,5ml KOH 10% Ống 2: thêm lượng nước cất tương đương.
Sau khi soi đèn:
Kết quả: ống 1 có huỳnh quang mạnh hơn dung dịch trong ống thứ 2
Có coumarin trong dịch chiết ether
47
2.1.7. Định tính anthraquinon
Lấy khoảng 5ml dịch ether cho vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào 1ml dung dịch NaOH 10% và lắc kỹ. Nếu lớp kiềm có màu hồng tới đỏ: có anthraquinon dạng tự do
Hình 3.34. Định tính anthraquinon trong dịch chiết ether (-)
Ống 1: ống chứng
Ống 2: ống thử - màu xanh lá nhạt, ở lớp trên màu xanh lá đậm
Không có màu hồng tới đỏ Không có anthraquinon dạng tự
do trong dịch chiết ether.
2.1.8. Định tính flavonoid
Lấy khoảng 10ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn khô. Hòa cắn với 2 ml cồn và gạn dịch cồn vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào dung dịch 1 ít bột magnesi kim loại và thêm từ từ 0,5ml HCl đậm đặc. Nếu sau phản ứng, dung dịch có màu hồng tới đỏ: có Flavonoid.
Hình 3.35. Định tính flavonoid trong dịch chiết ether (-)
Ống 1: ống chứng.
Ống 2: ống thử - màu xanh đậm Không có màu hồng tới đỏ Không có flavonoid trong dịch
48
2.2. Xác định các nhóm hợp chất tan trong dịch chiết cồn
1. Alkaloid 2. Coumarin 3. Glycosid tim 4. Flavonoid 5. Tannin 6. Saponin 7. Các chất khử 8. Acid hữu cơ
2.2.1. Định tính alkaloid
Hình 3.36. Định tính alkaloid trong dịch chiết cồn (+) Ống 1: ống chứng.
Ống 2: Thuốc thử Dragendorff (có tủa đỏ cam trong ống)
Ống 3: Thuốc thử Bouchardat (có tủa đỏ nâu trong ống)
Ống 4: Thuốc thử Valse – Mayer (có tủa vàng nhạt trong ống) Kết quả: có alkaloid trong dịch chiết cồn
2.2.2. Định tính coumarin