1.3 Tổng quan về các phƣơng pháp định lƣợng vitamin C.[6],[7],[9],[17],[18]
Việc phân tích vitamin C trong dƣợc phẩm nói riêng và các chế phẩm chứa vitamin C nói chung là điều cần thiết để phục vụ cho việc đánh giá chất lƣợng của sản phẩm đối với đời sống con ngƣời. Các phƣơng pháp định lƣợng vitamin C có thể đƣợc chia làm hai nhóm:
Phƣơng pháp vật lí Phƣơng pháp hóa học
Trong những phƣơng pháp hóa lý thì phƣơng pháp cực phổ có một ý nghĩa thực tế. Trong những năm gần đây phƣơng pháp này rất đƣuọc phát triển và đã đƣợc dùng để nghiên cứu vitamin C về mặt lý thuyết. Phƣơng pháp sắc ký với nhiều kiến thức mới quý giá đã đƣợc sử dụng để nghiên cứu acid ascorbic ở dạng kết hợp. Trong các phƣơng pháp đo màu, nhiều phƣơng pháp có ý nghĩa nhất đều dựa trên phản ứng của acid ascorbic dạng oxi hóa.
1.3.1 Phƣơng pháp hố học
1.3.1.1 Phƣơng pháp chuẩn độ acid – bazơ: dựa vào tính acid của vitamin C, có thể
Trong dung mơi nƣớc, axit ascorbic là axit phân ly hai nấc với các giá trị pKa lần lƣợt bằng 4,2 và 11,6 tƣơng ứng với sự phân ly H+ của nhóm –OH đính vào C3 và C2 . Axit ascorbic dễ dàng phản ứng với các dung dịch kiềm để tạo muối.
Để định lƣợng axit ascorbic có thể dùng phản ứng chuẩn độ nấc 1 với NaOH, chỉ thị phenolphatalein.
1.3.1.2 Phƣơng pháp chuẩn độ oxi hóa khử: dựa vào tính khử của vitamin C.
Axit L- ascorbic bị oxi hóa thành axit L- dehydroascorbic theo bán phản ứng oxihóa sau đây ( E0= 0,127V ở pH=5)
+ 2H+ + 2e- O HO OH O CH2OH H H OH O O O O CH2OH H H OH
Axit ascorbic Axit dehidroascorbic
Q trình oxy hóa ascorbic xảy ra ở hai mức độ khác nhau:
- Sự oxy hóa thuận nghịch vitamin C thành axit dehydroascorbic: tính chất này vơ cùng quan trọng đối với tác dụng sinh học của axit ascorbic là tham gia xúc tác các quá trình oxy hóa khử xảy ra trong cơ thể.
- Sự oxy hóa bất thuận nghịch biến vitamin C thành các sản phẩm khác khơng có hoạt tính và biến màu. Phản ứng này tăng nhanh theo pH và nhiệt độ của dung dịch.
Các chất oxy hóa thƣờng dùng để oxi hóa axit ascorbic là: brom, iot, thuốc thử Fehling, dung dịch KMnO4, dung dịch AgNO3, 2,6-diclorophenolindophenol…. Phƣơng pháp chuẩn độ đƣợc tiến hành bằng cách nhỏ từ từ dung dịch thuốc thử từ
+ NaOH HOH2C (CHOH)3 C O COONa + H2O O HO OH O CH2OH H H OH
buret vào dung dịch có chứa axit ascorbic trong môi trƣờng thích hợp. Điểm tƣơng đƣơng đƣợc nhận nhờ sự chuyển màu của dung dịch khi có chất chỉ thị thích hợp.
Phƣơng pháp đo Iod.
Cơ chế phản ứng của phƣơng pháp định lƣợng vitamin C bằng Iod.
+ I2 +2HI 2HI
dùng chỉ thị hồ tinh bột để nhận biết điểm tƣơng đƣơng. Dùng Amonium ceri (IV) sulfat.
Cơ chế phản ứng của phƣơng pháp định lƣợng vitamin C bằng Amonium ceri (IV) sulfat.
+ 2Ce+4 + 2Ce+3 + 2H+
Dựa vào sự thay đổi màu sắc của dung dịch Ceri để nhận biết. Dùng 2,6-diclorophenol-indophenol .
Cơ chế phản ứng của phƣơng pháp định lƣợng vitamin C bằng 2,6- diclorophenol-indophenol.
+
Acid ascorbic Acid dehydroascorbic Acid dehydroascorbic O O HO OH HC CH2OH OH O CH HO CH 2OH O O O O O HO OH HC CH2OH OH O CH HO CH2OH O O O N Cl Cl OH O O CH HO CH 2OH O O O O O HO OH HC CH2OH OH
Sản phẩm không màu
Nhận biết điểm tƣơng đƣơng: Xuất hiện màu hồng bền vững.
1.3.2 Phƣơng pháp hóa lí: 1.3.2.1 Phƣơng pháp cực phổ: 1.3.2.1 Phƣơng pháp cực phổ:
Cực phổ nghiệm là một trong những phƣơng pháp đặc trƣng nhất đƣợc dùng trong thực tế để định lƣợng hàng loạt. Acid ascorbic có tính chất cực phổ giống nhƣ các endiol khác về số sóng anot đơi điện tử khơng thuận nghịch. Tuy rằng sóng cực phổ của acid dehydroascorbic có tính khử, nhƣng nó nhiều lần thấp hơn song anot tƣơng ứng của acid ascorbic. Cơ chế này chƣa thực sự rõ ràng. Tính chất của acid ascorbic khi định lƣợng bằng phƣơng pháp oxi hóa và sự thay đổi thế năng chuẩn của nó đối với pH cho phép giả thiết rằng dạng endiol có khả năng trao đổi thuận nghịch đơi điện tử với điện cực.
1.3.2.2 Phƣơng pháp quang phổ tử ngoại khả kiến UV- VIS:
Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến đóng vai trị quan trọng trong kiểm nghiệm thuốc. Hầu hết các dƣuọc điển đã áp dụng phƣơng pháp này trong định tính, định lƣợng và thử tinh khiết các thuốc và chế phẩm.
a. Độ hấp thụ:
Khi cho bức xạ đơn sắc đi qua một mơi trƣờng có chứa chất hấp thụ thì độ hấp thụ của bức xạ tỷ lệ với nồng độ của chất hấp thụ và chiều dày của môi trƣờng hấp thụ (dung dịch chất hấp thụ). Mối quan hệ này tuân theo định luật Lambert – Beer và đƣợc biểu diễn bằng phƣơng trình sau:
D = lg = lg = KCL
Cl
Cl
NH OH
Trong đó: T: độ truyền qua
: cƣờng độ ánh sáng đơn sắc tới
I: cƣớng độ ánh sáng đơn sắc sau khi đã truyền ua dung dịch.
K: hệ số hấp thu phụ thuộc vào λ, thay đổi theo cách biểu thị nồng độ. L: chiều dài của lớp dung dịch
C: nồng độ chất tan trong dung dịch.
b. Ứng dụng phổ UV – VIS trong kiểm nghiệm thuốc
Định tính và thử tinh khiết
Định lƣợng: các phƣơng pháp định lƣợng.
Phƣơng pháp đo phổ trực tiếp: đo độ hấp thụ D của dung dịch, tính nồng độ C của nó dựa vào giá trị độ hấp thụ riêng ( có trong các bảng tra cứu).
D = . L. C L = 1cm C=
Để áp dụng phƣơng pháp này, cần phải chuẩn hóa máy quang phổ cả về bƣớc sóng lẫn độ hấp thụ.
Phƣơng pháp gián tiếp:
Các phƣơng pháp gián tiếp nhƣ: phƣơng pháp đƣờng chuẩn, so sánh và thêm chuẩn tƣơng tự nhƣ các phƣơng pháp hóa lí khác.
Đặc điểm của phƣơng pháp gián tiếp:
- Phải có chất chuẩn để so sánh - Có thể khơng cần phải chuẩn máy.
1.3.2.3 Phƣơng pháp sắc kí lỏng cao áp hiệu năng cao HPLC: a. Nguyên tắc:
Phƣơng pháp HPLC là phƣơng pháp phân tích hóa lý, dùng để tách và định lƣợng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với 2 pha ln tiếp xúc nhƣng khơng hịa lẫn vào nhau: Pha tĩnh (trong cột hiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải). Khi dung dịch của hỗn hợp các chất cần phân tích đƣa vào
cột, chúng sẽ đƣợc hấp phụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tùy thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích. Khi ta bơm dung mơi pha động bằng bơm với áp suất cao thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với hai pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách.
Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đƣợc phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi là detector và đƣợc chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng đƣợc hiển thị trên màn hình hoặc đƣa ra máy in.
b. Cơ sở lí thuyết:
Q trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lƣu giữ ra khỏi cột. Tùy theo bản chất pha tĩnh, chất tan và dung mơi mà q trình rửa giải tách đƣợc các chất khi ra khỏi cột sắc ký. Nếu ghi quá trình tách sắc ký, chúng ta có sắc đồ.
c. Cấu tạo hệ thống HPLC