CHƢƠNG I : TỔNG QUAN
1.3 Tổng quan về các phƣơng pháp định lƣợng vitami nC
1.3.2 Phƣơng pháp hóa lí
1.3.2.1 Phƣơng pháp cực phổ:
Cực phổ nghiệm là một trong những phƣơng pháp đặc trƣng nhất đƣợc dùng trong thực tế để định lƣợng hàng loạt. Acid ascorbic có tính chất cực phổ giống nhƣ các endiol khác về số sóng anot đơi điện tử khơng thuận nghịch. Tuy rằng sóng cực phổ của acid dehydroascorbic có tính khử, nhƣng nó nhiều lần thấp hơn song anot tƣơng ứng của acid ascorbic. Cơ chế này chƣa thực sự rõ ràng. Tính chất của acid ascorbic khi định lƣợng bằng phƣơng pháp oxi hóa và sự thay đổi thế năng chuẩn của nó đối với pH cho phép giả thiết rằng dạng endiol có khả năng trao đổi thuận nghịch đơi điện tử với điện cực.
1.3.2.2 Phƣơng pháp quang phổ tử ngoại khả kiến UV- VIS:
Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến đóng vai trị quan trọng trong kiểm nghiệm thuốc. Hầu hết các dƣuọc điển đã áp dụng phƣơng pháp này trong định tính, định lƣợng và thử tinh khiết các thuốc và chế phẩm.
a. Độ hấp thụ:
Khi cho bức xạ đơn sắc đi qua một mơi trƣờng có chứa chất hấp thụ thì độ hấp thụ của bức xạ tỷ lệ với nồng độ của chất hấp thụ và chiều dày của môi trƣờng hấp thụ (dung dịch chất hấp thụ). Mối quan hệ này tuân theo định luật Lambert – Beer và đƣợc biểu diễn bằng phƣơng trình sau:
D = lg = lg = KCL
Cl
Cl
NH OH
Trong đó: T: độ truyền qua
: cƣờng độ ánh sáng đơn sắc tới
I: cƣớng độ ánh sáng đơn sắc sau khi đã truyền ua dung dịch.
K: hệ số hấp thu phụ thuộc vào λ, thay đổi theo cách biểu thị nồng độ. L: chiều dài của lớp dung dịch
C: nồng độ chất tan trong dung dịch.
b. Ứng dụng phổ UV – VIS trong kiểm nghiệm thuốc
Định tính và thử tinh khiết
Định lƣợng: các phƣơng pháp định lƣợng.
Phƣơng pháp đo phổ trực tiếp: đo độ hấp thụ D của dung dịch, tính nồng độ C của nó dựa vào giá trị độ hấp thụ riêng ( có trong các bảng tra cứu).
D = . L. C L = 1cm C=
Để áp dụng phƣơng pháp này, cần phải chuẩn hóa máy quang phổ cả về bƣớc sóng lẫn độ hấp thụ.
Phƣơng pháp gián tiếp:
Các phƣơng pháp gián tiếp nhƣ: phƣơng pháp đƣờng chuẩn, so sánh và thêm chuẩn tƣơng tự nhƣ các phƣơng pháp hóa lí khác.
Đặc điểm của phƣơng pháp gián tiếp:
- Phải có chất chuẩn để so sánh - Có thể khơng cần phải chuẩn máy.
1.3.2.3 Phƣơng pháp sắc kí lỏng cao áp hiệu năng cao HPLC: a. Nguyên tắc:
Phƣơng pháp HPLC là phƣơng pháp phân tích hóa lý, dùng để tách và định lƣợng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với 2 pha ln tiếp xúc nhƣng khơng hịa lẫn vào nhau: Pha tĩnh (trong cột hiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải). Khi dung dịch của hỗn hợp các chất cần phân tích đƣa vào
cột, chúng sẽ đƣợc hấp phụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tùy thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích. Khi ta bơm dung mơi pha động bằng bơm với áp suất cao thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với hai pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách.
Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đƣợc phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi là detector và đƣợc chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng đƣợc hiển thị trên màn hình hoặc đƣa ra máy in.
b. Cơ sở lí thuyết:
Q trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lƣu giữ ra khỏi cột. Tùy theo bản chất pha tĩnh, chất tan và dung mơi mà q trình rửa giải tách đƣợc các chất khi ra khỏi cột sắc ký. Nếu ghi quá trình tách sắc ký, chúng ta có sắc đồ.
c. Cấu tạo hệ thống HPLC
1- Bình bơm dung mơi 4- Tiêm 7- Phần mềm xử lý 2- Bộ trộn dung môi 5- Cột 8- Máy in
3- Bơm 6- Detector
d. Định lƣợng bằng phƣơng pháp HPLC.
Tất cả các phƣơng pháp định lƣợng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích peak của nó.
Có 4 pháp định lƣợng đƣợc sử dụng trong sắc ký đó là: Phƣơng pháp chuẩn ngoại.
Phƣơng pháp chuẩn nội. Phƣơng pháp thêm chuẩn.
Phƣơng pháp chuẩn hóa diện tích.
Trong phạm vi của đề tài này, tôi chọn phƣơng pháp chuẩn ngoại là phƣơng pháp định lƣợng vitamin C có trong chế phẩm.
Phƣơng pháp chuẩn ngoại là phƣơng pháp định lƣợng cơ bản đƣợc sử dụng phổ biến trong sắc ký, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều đƣợc tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện.
So sánh diện tích ( hoặc chiều cao) peak của mẫu thử với diện tích ( hoặc chiều cao) peak của mẫu chuẩn sẽ tính đƣợc nồng độ của các chất có trong mẫu thử.
Các bƣớc tiến hành:
Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng dộ tăng dần rồi tiến hành sắc ký. Kết quả thu đƣợc là chiều cao hoặc diện tích peak ở mỗi điểm chuẩn.
Vẽ đồ thị biểu diễn sự tƣơng quan giữa diện tích ( hoặc chiều cao) peak với nồng độ chất chuẩn (C).
Sử dụng đoạn tuyến tính của đƣờng chuẩn để tính tốn nồng của chất cần xác định. Áp dữ kiện diện tích ( hoặc chiều cao) peak của chất thử vào đƣờng chuẩn sẽ suy ra nồng độ của nó.