1.3.2.1 Phƣơng pháp cực phổ:
Cực phổ nghiệm là một trong những phƣơng pháp đặc trƣng nhất đƣợc dùng trong thực tế để định lƣợng hàng loạt. Acid ascorbic có tính chất cực phổ giống nhƣ các endiol khác về số sóng anot đôi điện tử không thuận nghịch. Tuy rằng sóng cực phổ của acid dehydroascorbic có tính khử, nhƣng nó nhiều lần thấp hơn song anot tƣơng ứng của acid ascorbic. Cơ chế này chƣa thực sự rõ ràng. Tính chất của acid ascorbic khi định lƣợng bằng phƣơng pháp oxi hóa và sự thay đổi thế năng chuẩn của nó đối với pH cho phép giả thiết rằng dạng endiol có khả năng trao đổi thuận nghịch đôi điện tử với điện cực.
1.3.2.2 Phƣơng pháp quang phổ tử ngoại khả kiến UV- VIS:
Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến đóng vai trò quan trọng trong kiểm nghiệm thuốc. Hầu hết các dƣuọc điển đã áp dụng phƣơng pháp này trong định tính, định lƣợng và thử tinh khiết các thuốc và chế phẩm.
a. Độ hấp thụ:
Khi cho bức xạ đơn sắc đi qua một môi trƣờng có chứa chất hấp thụ thì độ hấp thụ của bức xạ tỷ lệ với nồng độ của chất hấp thụ và chiều dày của môi trƣờng hấp thụ (dung dịch chất hấp thụ). Mối quan hệ này tuân theo định luật Lambert – Beer và đƣợc biểu diễn bằng phƣơng trình sau:
D = lg = lg = KCL
Cl
Cl
NH OH
Trong đó: T: độ truyền qua
: cƣờng độ ánh sáng đơn sắc tới
I: cƣớng độ ánh sáng đơn sắc sau khi đã truyền ua dung dịch.
K: hệ số hấp thu phụ thuộc vào λ, thay đổi theo cách biểu thị nồng độ. L: chiều dài của lớp dung dịch
C: nồng độ chất tan trong dung dịch.
b. Ứng dụng phổ UV – VIS trong kiểm nghiệm thuốc
Định tính và thử tinh khiết
Định lƣợng: các phƣơng pháp định lƣợng.
Phƣơng pháp đo phổ trực tiếp: đo độ hấp thụ D của dung dịch, tính nồng độ C của nó dựa vào giá trị độ hấp thụ riêng ( có trong các bảng tra cứu).
D = . L. C L = 1cm C=
Để áp dụng phƣơng pháp này, cần phải chuẩn hóa máy quang phổ cả về bƣớc sóng lẫn độ hấp thụ.
Phƣơng pháp gián tiếp:
Các phƣơng pháp gián tiếp nhƣ: phƣơng pháp đƣờng chuẩn, so sánh và thêm chuẩn tƣơng tự nhƣ các phƣơng pháp hóa lí khác.
Đặc điểm của phƣơng pháp gián tiếp:
- Phải có chất chuẩn để so sánh
- Có thể không cần phải chuẩn máy.
1.3.2.3 Phƣơng pháp sắc kí lỏng cao áp hiệu năng cao HPLC: a. Nguyên tắc:
Phƣơng pháp HPLC là phƣơng pháp phân tích hóa lý, dùng để tách và định lƣợng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhƣng không hòa lẫn vào nhau: Pha tĩnh (trong cột hiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải). Khi dung dịch của hỗn hợp các chất cần phân tích đƣa vào
cột, chúng sẽ đƣợc hấp phụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tùy thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích. Khi ta bơm dung môi pha động bằng bơm với áp suất cao thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với hai pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách.
Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đƣợc phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi là detector và đƣợc chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng đƣợc hiển thị trên màn hình hoặc đƣa ra máy in.
b. Cơ sở lí thuyết:
Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lƣu giữ ra khỏi cột. Tùy theo bản chất pha tĩnh, chất tan và dung môi mà quá trình rửa giải tách đƣợc các chất khi ra khỏi cột sắc ký. Nếu ghi quá trình tách sắc ký, chúng ta có sắc đồ.
c. Cấu tạo hệ thống HPLC
1- Bình bơm dung môi 4- Tiêm 7- Phần mềm xử lý
2- Bộ trộn dung môi 5- Cột 8- Máy in
3- Bơm 6- Detector
d. Định lƣợng bằng phƣơng pháp HPLC.
Tất cả các phƣơng pháp định lƣợng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích peak của nó.
Có 4 pháp định lƣợng đƣợc sử dụng trong sắc ký đó là: Phƣơng pháp chuẩn ngoại.
Phƣơng pháp chuẩn nội. Phƣơng pháp thêm chuẩn.
Phƣơng pháp chuẩn hóa diện tích.
Trong phạm vi của đề tài này, tôi chọn phƣơng pháp chuẩn ngoại là phƣơng pháp định lƣợng vitamin C có trong chế phẩm.
Phƣơng pháp chuẩn ngoại là phƣơng pháp định lƣợng cơ bản đƣợc sử dụng phổ biến trong sắc ký, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều đƣợc tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện.
So sánh diện tích ( hoặc chiều cao) peak của mẫu thử với diện tích ( hoặc chiều cao) peak của mẫu chuẩn sẽ tính đƣợc nồng độ của các chất có trong mẫu thử.
Các bƣớc tiến hành:
Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng dộ tăng dần rồi tiến hành sắc ký. Kết quả thu đƣợc là chiều cao hoặc diện tích peak ở mỗi điểm chuẩn.
Vẽ đồ thị biểu diễn sự tƣơng quan giữa diện tích ( hoặc chiều cao) peak với nồng độ chất chuẩn (C).
Sử dụng đoạn tuyến tính của đƣờng chuẩn để tính toán nồng của chất cần xác định. Áp dữ kiện diện tích ( hoặc chiều cao) peak của chất thử vào đƣờng chuẩn sẽ suy ra nồng độ của nó.
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1Dụng cụ, hóa chất:
2.1.1 Dụng cụ:
Các dụng cụ thủy tinh dùng trong phân tích: ống nghiệm, bình tam giác, bình định mức, buret, pipet, phễu, cốc, đũa thủy tinh và một số dụng cụ cần thiết khác.
Các dụng cụ khác: cối chày, quả bóp cao su, bình tia nƣớc cất.
Thiết bị, máy móc: cân phân tích, máy đo độ rã, máy đo pH, máy đo quang phổ UV- VIS, máy sắc kí lỏng cao áp hiệu năng cao HPLC và một số thiết bị cần thiết khác.
2.1.2 Hóa chất:
Acid ascorbic chuẩn, dd Na2S2O3 chuẩn, I2 tinh thể, KIO3 tinh khiết, NaOH, dd AgNO3, CH3COOH, dd HCl, dd HNO3, Na2HPO4, KH2PO4, dd H3PO4, hồ tinh bột, phenolphthalein và một số hóa chất cần thiết khác.
2.2 Nguyên liệu:
Chế phẩm vitamin C sản xuất trong nƣớc lƣu hành trên thị trƣờng dƣới nhiều dạng bào chế khác nhau: viên nén, viên nang, dạng sủi, siro, viên ngậm, thuốc tiêm truyền… với hàm lƣợng dƣợc chất vitamin C có trong chế phẩm cũng khá đa dạng dao dộng trong khoảng từ 100- 1000mg.
Qua quá trình khảo sát tại các nhà thuốc, các quầy thuốc và một số bệnh viện tại thị trƣờng Thừa Thiên Huế cho thấy các chế phẩm dƣới dạng viên nén 500mg và dạng thuốc tiêm 500mg/5ml là các chế phẩm đƣợc lƣu hành phổ biến hơn cả.
Trong phạm vi của đề tài này, chúng tôi lựa chọn nghiên cứu một số chế phẩm của đại diện các đơn vị sau:
Bảng 2.1: Chế phẩm chƣa vitamin C viên nén 500mg.
STT Cơ sở sản xuất Số đăng kí Lô sản xuất
1 Công ty CPDP TW3 VD – 11170 – 10 3512 2013 2213 2713 2 Công ty CPDP Quảng Bình VD – 12925 – 10 11 13 27 3 Công ty CPDP Đại Uy - Hà Nội 2123/2011/YT –
CNTC
0212 0113 4 Công Ty CPDP Trung Ƣơng Vidipha VD – 17981 – 12 150613
5 Công ty LDDP Éloge France Viet Nam VD – 7354 - 09
13007 13015 13017 13016 13003 6 Công ty CPDP Euvipharm VD – 8608- 09 0383008 0382005 0383011 Viên nang 500mg:
Công ty CPDP Cửu Long Số đăng kí: VD – 15135 – 11 Số lô: 19291013, 06040513 Thuốc tiêm 500mg/5ml:
Bảng 2.2: Chế phẩm chứa vitamin C dạng thuốc tiêm 500mg/5ml.
STT Cơ sở sản xuất Số đăng kí Lô sản xuất
1 Ascorstad VD – 8221 – 09 031013
2 Công ty Pymepharco
Tuy Hòa Phú Yên Lanocorbic VD – 5800 – 08 010513
3 Công ty cổ phần
Fresenius Kabi Bidiphar VD – 18045 – 12
86GHA131, 86GHA143 4 Công ty cổ phần dƣợc phẩm
trung ƣơng Vidipha VD – 10463 - 10 100413
5
Công ty Laboratoire
Aguettant –France VN -14236 -11 T -2282B
2.3Pha một số dung dịch dùng trong phân tích:[5]
Pha dung dịch NaOH 0,1N
Hòa tan 4,5g NaOH trong 5ml H2O, đậy kín bằng nút cao su, để yên qua đêm, gạn phần dung dịch trong ở phía trên và pha loãng với nƣớc không có CO2 vừa đủ 1000ml.
Lấy chính xác 20ml dung dịch NaOH đã điều chế ở trên cho vào bình nón nút mài, thêm chất chỉ thị phenolphtalein và chuẩn độ bằng dung dịch HCl chuẩn 0,1N.
Pha dung dịch đệm sulfat pH = 2
Dung dịch 2: thêm từ từ 14ml H2SO4 vào khoảng 400ml H2O vừa thêm vừa khuấy vừa làm nguội. Để dung dịch nguội hoàn toàn, thêm H2O vừa đủ 500ml.
Trộn dung dịch 1 và 2 đồng thể tích. Pha dung dịch I2
Cân 3,25g Iod tinh thể, sau đó cân tiếp 5,00g KI trong 1 cốc có mỏ 250ml. Thêm 30ml H2O và khuấy trong tủ hút cho đến khi tan hoàn toàn. Thêm khoảng100ml H2O và lọc qua phễu có bông hút nƣớc vào bình định mức 250ml. Tráng cốc bằng 50ml H2O cất và lọc tiếp vào bình định mức này. Thêm H2O đến vạch, đậy nút, lắc đều.
Lấy đúng 25ml dung dịch I2 vừa pha cho vào bình nón nút mài, thêm 30ml H2O và chuẩn độ bằng dung dịch bằng dung dịch Na2S2O3 0,1N cho đến khi có màu vàng nhạt, thêm 2ml dung dịch hồ tinh bột và chuẩn độ tiếp cho đến khi mất màu.
Pha dung dịch KIO3
KIO3 tinh thể đƣợc sấy ở 1300C đến khối lƣợng không đổi.
Hòa tan 3,567g KIO3chuẩn gốc ở trên vào nƣớc vừa đủ đến 1000ml.
Lấy đúng 25ml dung dịch KIO3 vừa pha cho vào bình nón nút mài, thêm 30ml H2O và chuẩn độ bằng dung dịch bằng dung dịch Na2S2O3 0,1N cho đến khi có màu vàng nhạt, thêm 2ml dung dịch hồ tinh bột và chuẩn độ tiếp cho đến khi mất màu.
2.4 Phƣơng pháp thực nghiệm:
Trong phạm vi của đề tài này, các chế phẩm chứa vitamin C đƣợc đánh giá dựa trên một số các chỉ tiêu đƣợc qui định trong Dƣợc Điển Việt Nam IV nhƣ sau:
Đánh giá các chỉ tiêu về: tính chất cảm quan, độ rã ( đối với viên nén), độ đồng đều khối lƣợng ( đối với viên nén, viên nang), pH ( đối với thuốc tiêm), định tính.
Phƣơng pháp hóa học:
- Phƣơng pháp chuẩn độ acid – bazơ: chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N
- Phƣơng pháp chuẩn độ oxi hóa khử: chuẩn độ bằng dung dịch I2 0,1N đối với chế phẩm viên nén và viên nang; chuẩn độ bằng dung dịch KIO3 đối với chế phẩm thuốc tiêm.
Phƣơng pháp hóa lí:
- Phƣơng pháp quan phổ tử ngoại khả kiến UV – VIS. - Phƣơng pháp sắc kí lỏng cao áp hiệu năng cao HPLC.
2.3.1 Tính chất cảm quan:[5]
Đối với viên nén:
+ Viên rắn, hai mặt nhẵn, trên mặt có thể có rãnh, chữ hoặc ký hiệu, cạnh và thành viên lành lặn. Viên không bị gãy vỡ, bở vụn trong quá trình bảo quản, phân phối và vận chuyển.
+ Viên màu trắng hay trắng ngà (đối với viên không bao phim). + Viên giữ đƣợc màu bao phim ban đầu (đối với viên có bao phim). Đối với thuốc nang:
Nang cứng, bột thuốc trong nang màu trắng hoặc trắng ngà, không mùi. Đối với thuốc tiêm: Dung dịch trong, không màu hay màu vàng nhạt.
2.3.2 Độ đồng đều khối lƣợng ( đối với viên nén và viên nang)[5]
Viên nén:
Cân riêng khối lƣợng từng viên và so sánh với khối lƣợng trung bình, tính độ lệch theo tỷ lệ phần trăm của khối lƣợng trung bình, từ đó tính ra khoảng giới hạn của giá trị trung bình.
Viên nang:
Cân riêng biệt 20 đơn vị lấy ngẫu nhiên, tính khối lƣợng trung bình.
Cân khối lƣợng của một nang, tháo rời hai nửa vỏ nang, dùng bông lau sạch vỏ và cân khối lƣợng của vỏ. Khối lƣợng thuốc trong nang hay gói là hiệu số giữa khối lƣợng nang thuốc và khối lƣợng vỏ nang.
Tiến hành tƣơng tự với 19 đơn vị khác lấy ngẫu nhiên. Tính khối lƣợng trung bình của thuốc trong nang.
2.3.3 Độ rã: (đối với viên nén)[5]
Thuốc đƣợc coi là rã, khi đáp ứng một trong những yêu cầu sau: + Không còn cắn trên mặt lƣới.
+ Nếu còn cắn, đấy là khối mềm không có màng nhận thấy rõ, không có nhân khô. + Chỉ còn những mảnh vỏ bao của viên nén hoặc vỏ nang trên mặt lƣới. Nếu sử dụng
đĩa (trong trƣờng hợp cho viên nang), các mảnh vỏ nang có thể dính vào mặt dƣới của đĩa.
Yêu cầu:
+ Nếu 6 viên rã hết thì mẫu thử đạt yêu cầu.
+ Nếu còn dƣới 2 viên chƣa rã hết thì thử lại trên 12 viên nữa. Chế phẩm đạt yêu cầu về độ rã khi 16 trong 18 viên thử đạt độ rã theo quy định.
+ Viên nén không bao phải rã trong vòng 15 phút. + Viên bao bảo vệ rã trong vòng 30 phút.
2.3.4 Độ pH (đối với thuốc tiêm)[5]đo bằng máy pH met: Đối với thuốc tiêm pH quy định trong DĐVN IV là 5 đến 6,5. định trong DĐVN IV là 5 đến 6,5.
2.3.5 Định tính:[5]
Đối với viên nén và viên nang:
Cân một lƣợng bột viên tƣơng ứng với khoảng 0,10 g acid ascorbic, thêm 10 ml nƣớc. lắc kỹ, Lọc. Dịch lọc có phản ứng acid với giấy quỳ (TT). Lấy 5 ml dịch lọc thêm 0,5 ml dung dịch bạc nitrat 2 % (TT), xuất hiện tủa xám đen.
Đối với thuốc tiêm:
Lấy một lƣợng chế phẩm chứa khoảng 50 mg acid ascorbic, thêm 0,2 ml dung dịch acid nitric 2M (TT) và 0,2 ml dung dịch bạc nitrat 2% (TT). Xuất hiện tủa màu xám đen.
2.3.6 Định lƣợng:[5]
2.3.6.1 Định lƣợng bằng phƣơng pháp hóa học: 2.3.6.1.1 Chuẩn độ acid – bazơ:
Nguyên tắc:
Dùng chỉ thị phenolphtalein để nhận biết điểm tƣơng đƣơng.
Cách tiến hành:
Cân chính xác 20 viên, tính khối lƣợng trung bình và nghiền thành bột mịn.
+ NaOH HOH2C (CHOH)3 C O COONa + H2O O HO OH O CH2OH H H OH
+ Cân chính xác một lƣợng bột viên tƣơng ứng khoảng 0,2 (g) acid ascorbic (dựa vào khối lƣợng trung bình của viên và hàm lƣợng acid ascorbic ghi trên nhãn để xác định đƣợc lƣợng bột cần lấy).
+ Cho vào bình định mức 100 ml.
+ Thêm khoảng 1 gam axit oxalic vào bình định mức, thêm định mức đến 2/3 thể tích bình và lắc đều cho chất rắn tan hết sau đó định mức đến vạch mức bằng nƣớc cất. Nút kín bình để tránh sự oxi hóa của oxi không khí.
+ Hút chính xác 10 ml dịch lọc cho vào bình nón nút mài.Thêm chỉ chị phenolphtalein, chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N.
2.3.6.1.2 Chuẩn độ oxi hóa khử:
Đối với viên nén và viên nang dùng phƣơng pháp chuẩn độ Iod
Nguyên tắc:
+ I2 + 2HI
Dùng chỉ thị hồ tinh bột để nhận biết điểm tƣơng đƣơng.
Cách tiến hành định lƣợng nhƣ sau:
+ Cân chính xác 20 viên, tính khối lƣợng trung bình và nghiền thành bột mịn.
+ Cân chính xác một lƣợng bột viên tƣơng ứng khoảng 0,2 (g) acid ascorbic (dựa vào khối lƣợng trung bình của viên và hàm lƣợng acid ascorbic ghi trên nhãn để xác định đƣợc lƣợng bột cần lấy). + Cho vào bình định mức 100 ml. O O HO OH HC CH2OH OH O CH HO CH 2OH O O O
+ Thêm hỗn hợp (gồm 90 ml nƣớc đun sôi để nguội và 10 ml dung dịch acid acetic 1 M) vừa đủ tới vạch.
+ Lắc kỹ và lọc nhanh, dùng giấy lọc khô. + Loại bỏ 20 ml dịch lọc đầu.
+ Hút chính xác 10 ml dịch lọc cho vào bình nón nút mài.
+ Thêm 1 ml dung dịch hồ tinh bột và định lƣợng bằng dung dịch Iod 0,1 N cho đến khi xuất hiện màu xanh lam.
(1 ml dung dịch iod 0,1 N (chuẩn độ) tƣơng đƣơng với 8,806 mg C6H8O6. )
% vitamin C =
(So với hàm lƣợng ghi trên nhãn). Trong đó:
D: Tƣơng ứng với hàm lƣợng vitamin C ghi trên nhãn (g).
Khối lƣợng trung bình của 1 viên (g). mc: Lƣợng bột cân để định lƣợng (g).
: Thể tích dung dịch iod 0,1 N.
K: Hệ số hiệu chỉnh của dung dịch iod 0,1 N.
Đối với thuốc tiêm định lƣợng vitamin C bằng KIO3 0,1 N
+ Lấy chính xác một lƣợng chế phẩm tƣơng ứng khoảng 200 mg acid ascorbic (dựa